高菊逸 吴传安 杨伟康 罗裕旋 徐小平

流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae，HI）是一种没有运动能力的革兰阴性（G-）小杆菌，关于儿童社区获得性肺炎的大量研究证明，HI是引起细菌性肺炎较为常见的病原体之一，仅次于肺炎链球菌。根据HI荚膜多糖抗原的不同，可将其分为6个血清型（a～f型），其中 b型 HI（又称乙型 HI）是引起 5岁以下儿童细菌性脑膜炎的主要原因［1-4］。近年来，不少研究显示HI在免疫人群中的感染率也在不断地上升，不可分型的HI成为引起呼吸道感染的主要原因之一［3］。因此，研究一种快速经济的检测方法对于HI的早期鉴定及诊断具有重要的研究意义。

随着科技的不断发展，微流控芯片技术的集成化、小型化、高通量等特点在细菌检测中凸显优势［5-8］。本研究利用微流控芯片的以上特点建立了一种针对HI的快速检测技术平台，可在30 min内完成检测，且该方法具有灵敏度高、特异性强等优点，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验菌株 HI ATCC49247，肺炎克雷伯菌（香港大学深圳医院微生物科提供）。

1.2 仪器与试剂 对准型光刻机（韩国Midas公司），表面轮廓仪（中国威尔量仪公司），等离子清洗仪（成都铭恒公司），SU8光刻胶（美国Microchem公司），三甲基氯硅烷（德国ABCR公司），聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS，美国 Dow Coring公司），环烯烃聚合物（cycloolefin polymer, COP，美国Dow Coring公司），OCA（optically clear adhesive）光学透明胶（3M中国有限公司），倒置荧光显微镜（日本尼康仪器有限公司）；EC肉汤培养基（广东环凯公司）。

1.3 微流控芯片的设计制作及抗体固定 采用计算机辅助软件（Auto CAD）设计芯片通道及内部鱼骨结构，通道长 120 mm，宽 30 μm，鱼骨每段长 60 μm，宽30 μm，高10 μm。根据设计的图形制作掩膜，取干净硅片进行等离子清洗，旋涂SU8-3025光刻胶制作通道模板，同样操作使用SU8-3010光刻胶制作鱼骨模板，再使用三甲基氯硅烷进行硅烷化处理，5 min后倒入1：10 PDMS 184后水平静置30 min，置于80 ℃电热干燥箱烘烤30 min。将制作好的PDMS模板在120 ℃下压印在COP上，最后采用雕刻好的OCA光学透明胶将上下两层COP进行不可逆的键合，放入80 ℃电热干燥箱烘烤10 min，芯片制作完成。通过注射泵控制反应通道内反应液的流动，利用巯基-马来酰亚胺基团硅烷化偶联法，对反应检测区进行表面修饰和抗体固定［9-10］。

1.4 细菌菌悬液的配制 将HI过夜培养，取培养后的营养肉汤菌悬液0.2 mL，使用无菌生理盐水配制成浓度为1.5×104cfu/mL的菌液，通过平板菌落计数确定浓度。使用无菌生理盐水倍比稀释到1.5×103、1.5×102、1.5×101cfu/mL，共 4 个浓度，每个浓度各取1 mL菌液，沸水中煮30 min灭活后离心备用。肺炎链球菌ATCC49619、肺炎克雷伯菌按上述同样方法制备菌悬液备用。以高压灭菌的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）为阴性对照。

1.5 检测方法

1.5.1 选择最佳进样流速和进样时间 根据芯片设计的尺寸及检测样本的不同确定最佳进样流速和进样时间，参照本团队之前的研究数据为基础进行调整［11］，最终选择 4 个进样流速（2、4、6、8 μL/min）进行调试对比，每间隔5 min记录1次荧光信号强度值，直至60 min。

1.5.2 样品检测 取5 μL FITC标记羊抗HI抗原单克隆抗体，以上述实验中确定的最佳进样速度通入芯片内，反应30 min后用PBS冲洗，再将20 μL制备好的待测样品通入芯片，30 min后用PBS冲洗，在倒置荧光显微镜下观察芯片检测区域内的荧光信号，并使用高速电荷耦合器件（charge coupled device，CCD）拍照记录（20倍放大，曝光时间为1.25 s），采用Image-Pro Plus 5.0软件分析各检测区域的荧光信号强度。

1.5.3 检测芯片的检测限和特异性 将1.4项中制备的浓度为1.5×101～1.5×104cfu/mL的HI菌悬液分别以最佳进样流速和进样时间通入芯片内，以PBS作为阴性对照，在显微镜下观察并记录数据，利用公式：捕获率＝入口细菌浓度/出口细菌浓度×100%，计算对细菌的捕获率，得出芯片的检测限。将不同浓度肺炎链球菌ATCC49619、肺炎克雷伯菌按上述方法进行检测。采用SPSS 20.0软件对结果进行独立样本t检验，确定该微流控芯片的特异性。

1.5.4 检测芯片与平板培养法结果的总符合率 取30份浓度为1.5×103cfu/mL的HI菌悬液作为待测样本，30份无菌PBS作为阴性对照，分别进行平板过夜培养及芯片检测，计算微流控芯片的灵敏度及其与平板培养法的总符合率。

2 结果

2.1 微流控芯片的制作及优势 本研究根据HI的特性，在流体通道中增设了鱼骨结构，有效加大了HI与抗体的接触面积，并且通过阻力效应增加了HI与抗体反应的时间，显著提高了芯片的检测效率。

另外，HI大小仅为0.3～0.4 μm×1.5 μm，芯片内检测通道的高度对检测结果的影响重大，如果通道过高可能会导致HI无法接触表面抗体从而降低检出率，所以芯片的高度设计对其检测结果至关重要。本研究制作完成的芯片利用表面轮廓仪测量高度为24.870 μm，其中鱼骨高10 μm，将通道高度有效减少到了14.870 μm，对于HI的检出提供了有力的支持。见图1～2。

2.2 确定最佳进样流速和时间 不同流速下反应区域荧光信号强度变化见图3。当流速为2 μL/min时，反应区的荧光信号强度于1 h时可达到最高；当流速为4 μL/min时，荧光信号强度仍然保持高水平，达到最高值只需要30 min，并且存在较长时间的稳定期，有利于提高芯片内细菌检测的稳定性，之后当流速逐渐增快时，反应区内的荧光信号强度逐渐减弱。最终选择4 μL/min和30 min为最佳进样速度和反应时间。流速为4 μL/min时，芯片检测反应区的荧光信号见图4。

图1 1A为微流控芯片实物图，1B为显微镜下40倍放大鱼骨设计图

图2 微流控芯片内通道高度（精确到0.000 μm）

图3 不同进样流速下反应区荧光强度随时间变化曲线

图4 微流控芯片检测反应区荧光信号强度图（40倍放大）

图5 不同浓度HI菌悬液通过微流控芯片检测反应区的荧光信号强度图（40倍放大）

2.3 检测限 当HI浓度为1.5×104cfu/mL时，通道内对HI的捕获率明显较高，随着浓度的不断降低，捕获率也随之减少，当浓度为1.5×101cuf/mL时，通道内无法检测到荧光信号，捕获率为0。见图5。不同浓度HI菌悬液通过微流控芯片的捕获率比较见图6。根据捕获率及荧光强度确定本方法对HI的检测限为102cfu/mL。

图6 不同浓度HI菌悬液通过微流控芯片的捕获率

2.4 特异性 HI的捕获率为95%，明显高于肺炎链球菌和肺炎克雷伯菌（捕获率均为0），差异均有统计学意义（t1＝5.114，t2＝5.001，均 P＜0.01），证明此方法对HI的特异性为100%。

2.5 符合率 根据表1内数据计算芯片的灵敏度为90%（27/30），与平板培养法相比，总符合率为95%（57/60）。

表1 微流控芯片检测法与平板培养检测法结果比较

3 讨论

HI不仅是引起儿童呼吸道感染的常见病原菌，也是导致细菌性脑膜炎的主要原因［12］。长期以来，国内外对HI开展了大量的研究，并已成功将分子生物学、质谱等新技术应用于HI的检测［13］，但绝大部分是针对侵袭力较强的b型HI。目前临床上针对HI的检测方法较多，但仍然存在检测方法复杂、试剂成本较高、检测时间较长等缺点，且二级及以下医院及社区健康医疗服务中心无法满足设备与试剂需求，尚未有能力开展分子诊断及质谱诊断。针对以上不足，陶冶等［14］研制了一种胶体金试纸，以HI外膜蛋白P6为检测标志物，基于双抗体夹心免疫层系技术，可在15 min内完成检测，检测限为1×105cfu/mL，此方法虽然实现了快速检测，但检测限较高，容易出现假阴性现象。

近年来，微流控芯片的小型化、集成化特点在药品检测、肿瘤富集检测、微生物多重耐药检测等医学研究方面显示出特有的优势［15］。文小霞等［16］研制的微流控芯片能在15 h内完成细菌鉴定，检测限可达103cfu/mL，检测结果与传统方法的一致性达到96.3%。本研究制作的这款微流控芯片与其相比缩短了检测时间，在设计时增加的鱼骨结构能够有效将通道高度与HI大小匹配，经实验验证，该芯片灵敏度为90%，特异性为100%，与平板培养法检测结果比较，总符合率为95%。微流控芯片与临床上现有的检测方法相比，大幅度降低了样本和试剂的使用量，有效减少了检测时间，为临床早期治疗疾病提供了有力的诊断依据，适用于基层医疗单位及社区健康医疗服务中心，应用较为广泛。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突