葛瑞宏，李鹏冲，王 永，王法云，王 慧

（1.上海交通大学医学院公共卫生学院，上海市转化医学协同创新中心-食品安全与毒理学评价中心，上海 200025；2.河南省商业科学研究所有限责任公司，河南郑州 450002）

0 引言

苦荞麦（学名鞑靼荞麦） 属于蓼科荞麦属，是一种独特的药食两用的粮食作物，在欧亚很多国家具有多年食用历史。近年来，由于其颇高的营养价值和药用价值引起人们越来越多的关注[1-2]。苦荞麦中富含蛋白质、膳食纤维、抗性淀粉、不饱和脂肪酸、必需氨基酸、维生素、矿物质等营养成分[3-5]，活性成分中富含人体不能合成的芦丁、槲皮素等黄酮类化合物[6-7]，并被认为是芦丁、槲皮素的天然主要来源之一[8]。苦荞又分为黑苦荞和黄苦荞，黑苦荞中的芦丁含量是黄苦荞的3～5倍[9]。国内外大量试验研究结果表明，苦荞黄酮具有辅助降血糖功能，且黑苦荞黄酮提取率明显高于黄苦荞。张月红等人[10]通过体外试验和体内试验证明，苦荞乙醇提取物可降低餐后血糖，可能与其抑制α-葡萄糖苷酶活性有关。刘薇芝等人[11]研究表明，苦荞黄酮提取物可降低Ⅱ型糖尿病模型大鼠血糖与血脂水平。鲍涛[12]研究结果显示，苦荞黄酮对db/db小鼠的糖耐量和胰岛素耐量有显著改善。徐玉洁[13]研究表明，苦荞种子中性提取物可防治由链脲佐菌素诱导的Ⅱ型糖尿病。薛长勇[14]研究发现，苦荞黄酮具有降低血糖及血脂的作用，其作用途径可能是通过抑制糖苷酶、三酰甘油，激活过氧化物体增殖剂激活型受体γ和α而实现的。Dong Gi Lee等人[15]以db/db小鼠为试验对象，评价苦荞乙醇提取物的降血糖功能，结果表明，服用苦荞乙醇提取物的降糖效果与口服芦丁作用相似，具有降血糖功能。

以云南昭通山区黑苦荞为原料，以苦荞黄酮作为功效成分，研制黑苦荞胶囊保健食品，开展功效成分黄酮提取工艺及产品剂型工艺研究，并对产品进行质量评价。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑苦荞，上海极荞生物科技有限公司提供；芦丁标准品（≥98%，批号100080—201811），中国食品药品检定研究院提供；糊精、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、预胶化淀粉、硬脂酸镁（药用级），安徽山河药用辅料有限公司提供；无水乙醇，NaNO2，Al（NO3）3，NaOH，CH3COOK，MgCl2，K2CO3，NaBr，NaCl，KCl，KNO3等（分析纯），国药试剂（上海）有限公司提供；胶囊壳、乙醇（食品级），上海泰坦科技股份有限公司提供。

DF1000型手提式高速中药材粉碎机，江阴市丫匀机械制造有限公司产品；SXT-06型索氏提取器，上海洪纪仪器设备有限公司产品；AB135-S型电子分析天平，上海梅特勒托利多仪器有限公司；Multiskan Spextrum型酶标仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品；RE-2000B型旋转蒸发器、DZF-6053型真空干燥箱、DHP-9082型电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；PL-810A型水分测试仪，上海品重检测设备有限公司产品；JL-A3型粉体综合特性测试仪，成都精新粉体测试设备有限公司产品；LB-2D型崩解仪，上海黄海药检仪器有限公司产品；THC-1型数显温湿度计，广州乐享电子有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 黑苦荞胶囊制备工艺流程

黑苦荞→粉碎→乙醇回流提取→抽滤→真空浓缩→真空干燥→混合辅料→制粒→胶囊灌装→成品。

1.2.2 操作要点

（1）原料处理。优选云南山区黑苦荞原料，清洗后烘干，粉碎、过筛。

（2）黑苦荞黄酮提取制备。准确称取制备的黑苦荞粉，按照一定料液比，使用乙醇溶液回流提取一定时间后，真空抽滤得苦荞黄酮提取液。

（3）黑苦荞黄酮粉制备。提取的黑苦荞黄酮提取液真空浓缩后，60～80℃真空干燥至含水量低于6%，得到黑苦荞黄酮粉。

（4）原辅料混合。以黑苦荞黄酮粉为主要成分，按比例添加辅料，混合均匀。

（5）制粒、装胶囊、包装。将一定体积分数的乙醇作为润湿剂加入到原料粉中进行制粒。

用40目筛网制成湿颗粒，取40～60目的颗粒灌装胶囊、包装。

1.2.3 指标测定

（1） 芦丁标准曲线的制作。采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定苦荞乙醇提取液中黄酮类化合物含量，以芦丁为标准品于波长510 nm处测吸光度[16]。芦丁标准品100℃烘干至质量恒定后，用体积分数60%的乙醇配制成质量浓度0.625 mg/mL的标准品溶液。精确吸取该标准品 0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 mL，置于25 mL具塞试管中，用60%乙醇定容至12.5 mL刻度，加入0.7 mL质量分数5%的NaNO2溶液，摇匀、静置6 min，再加入质量分数10%的 Al（NO3）3溶液 0.7 mL，摇匀、放置 6 min，加质量分数4%的NaOH溶液2 mL，用60%乙醇定容至刻度，摇匀、放置10 min后，以60%乙醇为空白对照，测定其在波长510 nm处的吸光度。以标准液质量浓度C（mg/mL） 为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程Y=10.789X+0.094 8，R2=0.999 2（质量浓度为 0.01～0.06 mg/mL）。

（2）总黄酮提取率测定。将苦荞黄酮提取液定容后准确移取1 mL置于25 mL具塞试管，按照标准曲线制作的方法测定其在波长510 nm处的吸光度，总黄酮提取率按下式计算。

（3）吸湿率的测定。将底部盛有氯化钠过饱和溶液的玻璃干燥器置于25℃的恒温培养箱内48 h，此时干燥器内的相对湿度为75%。在已恒质量的称量瓶底部放入厚约2 mm的药粉，准确称量后置于上述玻璃干燥器内（称量瓶盖打开）25℃保存，定时（4，8，24，48，72，96，120 h） 称量，按下式计算吸湿率，并以吸湿率为纵坐标，时间为横坐标作图[17]。

（4）休止角测定。使用综合粉体测试仪测定粉体休止角，考查其流动性。读出圆锥体的直径和高度，计算出粉体的休止角（tgα=H/R），重复3次，取平均值[18]。以休止角来评价粉体的流动性，一般认为休止角大于40°时流动性不好，休止角小于40°时可直接充填[19]。

（5）颗粒成型率测定。颗粒成型率为整粒后粒度在40～60目的颗粒占总颗粒的比例。制得的40～60目大小的颗粒数量占总颗粒数比例低于20%者为成型性差；高于20%而低于50%者为成型性一般；高于50%者为成型性好[20]。

（6） 堆密度的测定。采用量筒法，精密称取3份一定量的黑苦荞降血糖颗粒，将其置于10 mL的量筒中，轻轻敲打量筒的外壁，使颗粒均匀填充于量筒中，读出体积并计算颗粒的堆密度。

（7）临界相对湿度的测定。胶囊内容物生产封装过程中环境因素会直接影响产品的质量，在生产过程中相对湿度是主要的影响因素，对胶囊内容物通过平衡吸湿性试验，绘制吸湿平衡曲线，得到颗粒的临界相对湿度，具体操作步骤如下：

取胶囊的填充物料颗粒6份，分别置于已干燥恒质量的称量瓶中，精密称定；将称量瓶在开盖状态下，分别置于底部盛有7种饱和溶液的玻璃干燥器中，于不同湿度的干燥器中在25℃的恒温培养箱内放置96 h；取出称量瓶加盖精密称定，计算颗粒的吸湿率；以吸湿率为纵坐标，相对湿度为横坐标绘制曲线，分析得到颗粒的临界相对湿度值，进而确定生产环境的相对湿度[22-24]。

（8）水分测定。取黑苦荞胶囊适量，倾出内容物，混合均匀，取约1 g左右的颗粒置于快速水分测定仪中，测定内容物的水分，每批次样品测定3次，连续测定3个批次的样品。

（9）装量差异[25]。取3批黑苦荞胶囊，每批样品10粒，精密称定各胶囊的质量后，将内容物倾出，操作过程不得损坏胶囊壳，并用小刷将胶囊壳刷净，精密称定囊壳质量，计算出每粒内容物的装量，并将每粒装量与平均装量比较。

（10） 崩解时限[25]。根据中国药典（2015版） 胶囊剂崩解时限的测定方法，测定3批黑苦荞胶囊的崩解时限，每批样品取6粒，置于崩解仪中测定。

1.2.4 工艺优化试验

先通过单因素试验分别考查苦荞粉粒径、提取溶剂浓度、提取时间、提取温度、料液比等因素对苦荞总黄酮提取率的影响，再通过正交试验确定最佳工艺条件。

（1）苦荞粉粒径对总黄酮提取率的影响。苦荞粉碎后，分别过80，100，120，140，160目筛网，收集不同粒径的苦荞粉，在提取温度80℃，料液比1∶30（g∶mL），提取时间2.5 h的条件下，使用70%乙醇回流提取黄酮，考查苦荞粉粒径对总黄酮提取率的影响。

（2）乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。设置提取温度80℃，料液比1∶30（g∶mL），提取时间2.5 h，分别用50%，60%，70%，80%，90%，100%体积分数的乙醇对苦荞黄酮进行提取，考查不同乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。

（3）料液比对总黄酮提取率的影响。设置提取温度80℃，乙醇体积分数70%，提取时间2.5 h，料液比分别在 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（g∶mL） 的条件下对苦荞黄酮进行提取，考查不同料液比对总黄酮提取率的影响。

（4）提取时间对总黄酮提取率的影响。设置提取温度80℃，乙醇体积分数70%，料液比1∶30（g∶mL），分别对苦荞黄酮进行 1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h的提取，考查不同提取时间对总黄酮提取率的影响。

（5）提取温度对总黄酮提取率的影响。设置料液比1∶30（g∶mL），乙醇体积分数70%，提取时间2.5 h，分别在50，60，70，80，90℃提取温度条件下对苦荞黄酮进行提取，考查提取温度对总黄酮提取率的影响。

（6）苦荞黄酮提取正交试验。在单因素试验基础上，设计正交试验。

苦荞黄酮提取工艺正交试验因素与水平设计见表1。

表1 苦荞黄酮提取工艺正交试验因素与水平设计

（7）胶囊剂型中辅料的筛选。苦荞黄酮粉吸湿性较强，直接填充胶囊会出现质量差异大、胶囊壳易脆裂等情况，影响产品的品质。为改善粉体的性质，可加入合适的辅料。辅料能一定程度上改善主药的吸湿情况，防止吸潮[21]。试验筛选微晶纤维素、糊精、预胶化淀粉、羧甲基纤维素钠4种辅料，按照质量比1∶1与苦荞黄酮粉混合后，测定各组样品的吸湿率，通过比较确定适宜的辅料。

（8）辅料添加量的确定。将苦荞黄酮粉与优选辅料分别按照质量比2.0∶1.0，1.5∶1.0，1.0∶1.0，1.0∶1.5，1.0∶2.0均匀混合，以吸湿率为指标，考查不同原辅料比例对吸湿率的影响，确定辅料适宜的添加量。

（9） 制粒工艺中润湿剂考查。称取6份苦荞黄酮与辅料的混合粉，分别用75%，80%，85%，90%，95%，100%乙醇进行制粒，用40目筛网制成湿颗粒，并观察制软材及软材过筛情况，于60℃真空干燥，再通过40目筛整粒，60目筛去细粉，收集颗粒称量，计算颗粒成型率。

（10）黑苦荞胶囊质量分析。在最优工艺条件下连续制备3批黑苦荞胶囊样品，进行水分含量、装量差异、崩解时限的检测与评价。

1.3 数据处理

采用正交设计助手ⅡV3.1统计分析软件进行正交试验结果分析，图形制作采用Excel和Origin 8.0数据处理软件。

2 结果与分析

2.1 乙醇回流法提取苦荞黄酮工艺研究

2.1.1 苦荞粉粒径对总黄酮提取率的影响

苦荞粉粒径对总黄酮提取率的影响见图1。

图1 苦荞粉粒径对总黄酮提取率的影响

由图1可知，苦荞总黄酮提取率随着粒径的减小而增大，苦荞粒径从80目减小到100目，总黄酮提取率显著增加（p＜0.05）。可能是由于苦荞粉碎后，颗粒粒度变小，单位质量药材的总比表面积增大，促进溶剂的渗透及活性物质黄酮的提取速度，有利于提高提取效率[26]。苦荞粒径从100目增加到160目，总黄酮提取率变化不大，因此可将苦荞粉粒径控制在100目。

2.1.2 乙醇体积分数对总黄酮提取率影响

乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响见图2。

图2 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

由图2可知，结果表明当乙醇体积分数小于60%时，总黄酮提取率随着乙醇体积分数的增加而升高，由于乙醇体积分数增大，其极性变小，有利于极性较小的黄酮类化合物的溶出，故得率呈上升趋势[27]。乙醇体积分数为60%时，总黄酮提取率最高。当乙醇体积分数大于60%时，总黄酮提取率随着乙醇体积分数的增加呈现下降趋势，可能是由于一些醇溶性杂质、色素、亲脂性成分的溶出量增加，与黄酮类化合物竞争乙醇，从而导致黄酮类化合物的得率降低[28]。因此，确定提取乙醇体积分数为60%。

2.1.3 料液比对总黄酮提取率的影响

料液比对总黄酮提取率的影响见图3。

图3 料液比对总黄酮提取率的影响

由图3可知，料液比大于1∶30时，总黄酮提取率随着料液比的减少呈现上升趋势；料液比为1∶30时，总黄酮提取率最高；料液比低于1∶30时，总黄酮提取率随着料液比的降低呈现下降趋势。料液比影响溶剂的极性，从而影响不同极性黄酮类的溶解性，同时能耗也随着料液比的降低而增大[29]。因此，确定料液比为1∶30。

2.1.4 提取时间对总黄酮提取率的影响

提取时间对总黄酮提取率的影响见图4。

图4 提取时间对总黄酮提取率的影响

由图4可知，提取时间小于2.5 h时，总黄酮提取率随着提取时间的增加而提高；提取时间2.5 h时，总黄酮提取率达最大值；提取时间超过2.5 h后，总黄酮提取率随着提取时间增加呈现下降趋势，原因可能是时间的增大有利于黄酮类物质的溶出，超过最佳提取时间后，部分黄酮类物质随着加热时间的延长而分解，导致得率下降[30-31]。因此，将提取时间确定为2.5 h。

2.1.5 提取温度对总黄酮提取率的影响

提取温度对总黄酮提取率的影响见图5。

由图5可知，总黄酮提取率随着提取温度的升高而增加，提取温度从60℃增加到80℃，总黄酮提取率显著增加（p＜0.05），在80℃时达到最高点。温度继续增加，总黄酮提取率变化不大。因此，确定提取温度为80℃。

2.1.6 苦荞乙醇回流提取正交试验

图5 提取温度对总黄酮提取率的影响

苦荞黄酮提取正交试验结果见表2。

表2 苦荞黄酮提取正交试验结果

由表2的因素极差值大小可以看出，以总黄酮提取率为评价指标，影响苦荞黄酮提取试验因素的主次顺序为 C＞B＞D＞A，最优条件组合是 A2B3C2D2。经过3次试验得出平均总黄酮提取率为44.68±2.29 mg/g，高于正交试验中A3B3C2D1最佳组合，因此最终确定A2B3C2D2为最优组合，即乙醇体积分数60%，料液比1∶35（g∶mL），提取时间150 min，提取温度80℃。

苦荞黄酮提取方差分析（α=0.05） 见表3。

表3 苦荞黄酮提取方差分析（α=0.05）

由表3可知，因素B料液比和因素C提取时间的差异在α=0.05水平上都是显著的。

2.2 黑苦荞胶囊工艺研究

2.2.1 辅料的筛选

不同辅料对吸湿率的影响见图6。

图6 不同辅料对吸湿率的影响

由图6可知，在24 h内，各种粉体的吸湿率随着时间的增加迅速增加，24 h后吸湿率趋于相对稳定；辅料添加后能够明显降低苦荞黄酮粉的吸湿率，以添加微晶纤维素的粉体吸湿率降低最多，120 h时间内吸湿率均低于9%，中国药典规定胶囊剂的含水量不得超过9%。选择微晶纤维素作为添加辅料。

2.2.2 辅料用量考查

将苦荞黄酮粉与微晶纤维素按不同比例进行混合，考查不同原辅料比例对吸湿率的影响。

苦荞黄酮粉与微晶纤维素不同质量比对吸湿率的影响见图7。

图7 苦荞黄酮粉与微晶纤维素不同质量比对吸湿率的影响

由图7可知，不同原辅料比例吸湿性呈现相似的规律，在24 h内，吸湿率随着时间增加迅速升高，24 h后吸湿率趋于稳定。苦荞黄酮粉与微晶纤维素质量比为1.0∶1.5和1.0∶2.0时吸湿率最低，然而二者质量比在1.5∶1.0时，吸湿率即低于9%，结合产品配方考虑，确定苦荞黄酮粉与微晶纤维素质量比为1.5∶1.0。

2.2.3 制粒工艺

（1）粉体休止角测定。将苦荞黄酮粉与微晶纤维素按优选质量比均匀混合，用综合粉体测定仪进行休止角测定。

粉体休止角测定结果见表4。

表4 粉体休止角测定结果

由表4可知，休止角测定结果大于40°，说明粉体流动性不够，通过制粒可以增加物料的流动性，因此进行制粒工艺研究。

（2）制粒工艺中润湿剂的确定。

润湿剂对颗粒成型率的影响见表5。

表5 润湿剂对颗粒成型率的影响

由表5可知，乙醇体积分数为85%时颗粒成型率最高；制粒过程中，当乙醇体积分数低于85%时，虽然容易制粒但是物料容易起团；乙醇体积分数高于85%时，虽然不易起团，但是制粒较困难；而当85%乙醇作为润湿剂时物料容易制粒且不易起团，故采用85%乙醇作为润湿剂用于颗粒制备。

（3）内容物休止角。取制粒后的内容物进行休止角的测定，平行测定3次。

胶囊内容物的休止角见表6。

表6 胶囊内容物的休止角

内容物的休止角均小于40°，表明其流动性符合胶囊的灌装要求[19]。

（4）胶囊型号的考查。

颗粒堆密度测定结果见表7。

表7 颗粒堆密度测定结果

由表7可知，颗粒的堆密度为0.657 g/mL。前期研究表明，每天需服用的产品剂量为2.7 g，若分为2次服用，每次3粒，则每粒的质量为0.45 g，根据颗粒堆密度计算所需胶囊的体积为0.68 mL，故选用0号胶囊壳用于黑苦荞降血糖颗粒的灌装。

（5）临界相对湿度的测定。以吸湿率为纵坐标，相对湿度为横坐标做不同环境下吸湿率曲线图，再作曲线的切线，其交点横坐标即为临界相对湿度。

临界相对湿度的测定见表8，胶囊内容物的临界相对湿度曲线见图8。

从图8可看出，该品的临界相对湿度为67.85%，当相对湿度＜67.85%时，粉末的吸湿性不强，当相对湿度＞67.85%时，粉末吸湿性明显增加，故生产环境相对湿度应控制在67.85%以下。

表8 临界相对湿度的测定

图8 胶囊内容物的临界相对湿度曲线

2.3 黑苦荞胶囊质量分析

2.3.1 水分

黑苦荞胶囊水分含量测定见表9。

表9 黑苦荞胶囊水分含量测定

由表9可知，3批样品的水分含量分别为5.12%±0.29%，5.10%±0.48%，5.33%±0.29%，符合中国药典（2015版） 胶囊剂中水分不得高于9%的质量要求[25]。

2.3.2 装量差异

中国药典（2015版） 中胶囊剂装量差异要求，平均装量或标示装量0.30 g及0.30 g以上装量差异限度为±7.5%。取3批黑苦荞胶囊，每批样品10粒，测定装量差异。

黑苦荞胶囊装量差异见表10。

由表10可知，3批样品均未超出装量差异限度，符合2015版《中国药典》的要求。

2.3.3 崩解时限

根据中国药典（2015版）胶囊剂崩解时限的测定方法，测定3批黑苦荞胶囊的崩解时限，每批样品取6粒，置于崩解仪中测定[25]。结果显示，3批样品的崩解时限分别为6，7，6 min， 均符合中国药典（2015版）胶囊剂崩解时限的质量要求。

3 结论

苦荞黄酮具有辅助降血糖功能。以苦荞黄酮作为功效成分，选用黄酮提取率较高的黑苦荞为原料，制备胶囊保健食品，对制备工艺进行研究，并对产品质量进行检测评价。

表10 黑苦荞胶囊装量差异

以总黄酮提取率为指标，对黑苦荞黄酮的提取工艺进行优化，确定苦荞粉粒径100目，最优提取条件为乙醇体积分数60%，料液比1∶35（g∶mL），提取温度80℃，提取时间150 min；胶囊剂型工艺研究中，为改善胶囊内容物的性质，筛选微晶纤维素作为辅料，并确定适宜添加量，苦荞黄酮粉与微晶纤维素质量比1.5∶1。

为改善粉体的流动性，对粉体进行制粒，以颗粒成型率为评价指标筛选85%乙醇作为润湿剂。制粒后颗粒休止角小于40°，流动性满足生产要求；最后通过颗粒堆密度的测量，选定0号胶囊灌装；通过临界相对湿度的测定确定生产环境相对湿度控制在67.85%以下。

最后对黑苦荞胶囊进行质量评价，3批样品的水分含量未超过9.0%，装量差异未超过±7.5%，崩解时限未超过30 min，均符合中国药典规定。

在接下来的工作中，将开展黑苦荞胶囊的功能学动物试验研究，对其功能性进行检测和评价。