侯宇峰 蒲亚岚 张凤娟 蒋绍军

帕金森是老年人群的常见的以纹状体多巴胺神经递质减少以及中脑黑质多巴胺能神经元变性为主要特征的神经元退行性疾病，严重损害身体健康并降低生活质量[1]。目前尚且没有有效地治疗方法阻止或修复帕金森引发的神经细胞损伤。关于帕金森的致病机理，有诸多研究表明其与基因突变、蛋白水解应激、氧化应激、免疫学异常、线粒体功能障碍、泛素蛋白酶体系统功能障、细胞凋亡碍等诸多机制有关，最终通过多种级联反应导致多巴胺能神经细胞凋亡、变性和坏死[2]。其中，氧化应激引起的线粒体功能异常、内质网应激引起的蛋白质折叠异常等因素都可称为帕金森分发病诱因[3]。当前的研究热点集中于降低神经元的氧化应激损伤，抑制神经元凋亡。Paralemmin-3(PALM3)属于Paralemmin蛋白家族，于1992年首次在非洲爪蛙中被发现[4]，并发现其可参与膜蛋白的运输、参与信号传导[5]。Chen等[6，7]研究在急性肺损伤的研究中发现，敲低PALM3能够显著提高细胞的抗氧化应激能力，从而显著抑制细胞凋亡。这些表明PALM3在保护细胞免受氧化应激刺激中起着关键作用。为研究PALM3在保护神经细胞中的作用，本实验采用6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)处理的SH-SY5Y细胞制造帕金森神经损伤模型，通过敲低PALM3，观察比较6-OHDA对细胞的损伤作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 将SH-SY5Y细胞(购自国家实验细胞资源共享平台)铺板于含有10%胎牛血清(Gibco，10099141)的D-MEM/F12(1∶1)培养基(Gibco，12400-024)，置于37℃，5%CO2条件下培养。用0.25%胰酶(Gibco，25300054)消化细胞，3 d传代一次。将细胞分为4组，不做任何处理的细胞组为对照组；用100 μmol/L 6-OHDA处理的细胞组为模型组；转染control siRNA的细胞组为siRNA-control组以及转染干扰PALM3的细胞组为siRNA-PALM3组。

1.2 RNA干扰 搜索PALM3在NCBI上的序列(NM_001367327.1，1104-1126，TTCCATAGAAGGGGAAGATGTGC)，利用在线工具siDirect version 2.0(http://sidirect2.rnai.jp/)设计并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成小干扰RNA(Small interfering RNA；siRNA):5’-ACAUCUUCCCCUUCUAUGGAA-3’及5’-UGUAGAAGGGGAAGAUACCUU-3’。同时合成阴性对照siRNA：5’-UAUGGAAUUCCCCUUCACAUC-3’及5’-ACCUUGAAGGGGAAGAUUGUA-3’。将阴性对照siRNA转染至siRNA-control组细胞，干扰PALM3的siRNA转染至siRNA-PALM3组细胞。转染6 h后更换培养基，继续培养24 h后，RT-PCR和Western blot方法检测4组细胞中的PALM3的表达水平。实验重复3次。

1.3 RT-PCR检测 收集上述4组细胞样品，提取RNA后，使用全式金公司的TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix(AT401-01)试剂盒进行反转录，获得cDNA。根据GeneBank中PALM3的序列(NM_001367327.1)并借助primer 5.0设计特异性引物(F：5’-AAAGTTGAGGGACATTTGAGG-3’；R：5’-AGCAGTGGCTGGCATTCG-3’)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将上述cDNA作为模板，按照PCR程序进行扩增：95℃，5 min；95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min；30个循环；72℃，10 min。PCR产物经核酸凝胶电泳后置于Bio-Rad凝胶成像系统(SYSTEM GelDoc XR+，1708195) 中成像。使用Image J分析软件进行灰度值分析，检测PALM3的转录水平。实验重复3次。

1.4 Western blot检测 收集上述4组细胞，进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳：浓缩胶恒压80 V， 20 min；分离胶恒压120 V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。使用Bio-Rad半干转印槽(Trans-Blot SD，170-3940)在恒压15 V，30 min条件下转印至PVDV膜(生工，F019532-0010)。取下PVDF膜放入封闭液(TBST，5%脱脂奶粉，pH值7.4)中室温孵育2 h；使用abcam公司生产的PALM3一抗稀释液(ab189996，1∶5 000)室温孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；使用全式金公司生产的HRP标记的二抗羊抗兔IgG 稀释液(HS101-01，1∶10 000)室温孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；最后根据ECL化学发光液(上海天能)使用说明，将PVDF膜置于Bio-Rad凝胶成像系统中显影。实验重复3次。

1.5 细胞凋亡检测 用Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(Sigma，APOAF-20TST)检测各组细胞凋亡情况。同时购买abcam公司的一抗及相应二抗，用Western blot方法检测各组细胞内p53(abcam，ab26)、Bcl-2(abcam，ab692)、Bax(abcam，ab77566)以及活化的caspase-3(abcam，ab13585)、caspase-9(abcam，ab69514)等蛋白的表达水平。

1.6 氧化应激指标检测

1.6.1 ROS检测：收集上述4组细胞，使用Abcam公司的DCFDA Cellular Ros Detection Assay Kit (Abcam ab113851)并按照其说明书操作，检测4组细胞内的ROS含量。

1.6.2 LDH检测：收集4组细胞培养液，使用碧云天生物技术公司的乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(C0016) 并按照其说明书操作，检测各组细胞培养液中的LDH含量。

1.6.3 GSH检测：收集4组细胞，使用碧云天生物技术公司的GSH和GSSG检测试剂盒(S0053) 并按照其说明书操作，检测各组细胞中的GSH含量。

2 结果

2.1 PALM3蛋白表达检测 RT-PCR结果显示，PALM3在对照组、模型组和siRNA-control组的细胞中的转录水平无显著差异(P>0.05)；PALM3在siRNA-PALM3组的转录水平较其他3组显著降低(P<0.05)。Western blot结果显示，PALM3在对照组、模型组和siRNA-control组的细胞中的表达水平无显著差异(P>0.05)；PALM3在siRNA-PALM3组的表达水平较其他3组显著降低(P<0.05)。以上结果表明siRNA-PALM3组中细胞中PALM3敲低成功，该组细胞内PALM3的表达被抑制。见图1、2，表1、2。

图1 PALM3在各组细胞中的转录水平

表1 PALM3在各组细胞中的转录水平

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与siRNA-control组比较，△P<0.05

图2 PALM3在各组细胞中的表达水平

表2 PALM3在各组细胞中的表达水平

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与siRNA-control组比较，△P<0.05

2.2 PALM3敲低对SH-SY5Y细胞凋亡的影响 流式细胞术结果显示，与对照组相比，模型组、siRNA-control组及siRNA-PALM3组内细胞凋亡数显著增加(P<0.05)，表明6-OHDA成功诱导SH-SY5Y细胞凋亡。与模型组相比，siRNA-PALM3组细胞凋亡数显著降低(P<0.05)，表明敲低PALM3，可显著抑制6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。见图3，表3。

图3 PALM3敲低对SH-SY5Y细胞凋亡的影响

表3 PALM3敲低对SH-SY5Y细胞凋亡的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与siRNA-control组比较，△P<0.05

2.3 PALM3敲低对凋亡信号蛋白表达的影响 与对照组比较，其他3组的p53和Bcl-2表达量显著降低(P<0.05)；与模型组相比，siRNA-PALM3组细胞的p53和Bcl-2表达量显著升高(P<0.05)。Bax，活化的Caspase-3及Caspase-9在模型组、siRNA-control组和siRNA-PALM3组的表达量较对照组显著升高(P<0.05)；与模型组相比，siRNA-PALM3组细胞中的上述3种蛋白表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4，表4。

图4 PALM3敲低对凋亡信号蛋白表达的影响

表4 PALM3敲低对凋亡信号蛋白表达的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与siRNA-control组比较，△P<0.05

2.4 PALM3敲低对氧化应激指标的影响 相比对照组，其他组细胞内ROS及细胞培养液中的LDH含量均显著增高(P<0.05)；与模型组相比，siRNA-PALM3组细胞的p53和Bcl-2表达量显著升高(P<0.05)。相比对照组，其他组细胞内GSH含量均显著降低(P<0.05)；与模型组相比，siRNA-PALM3组细胞的p53和Bcl-2表达量显著降低(P<0.05)。见表5。

表5 PALM3敲低对氧化应激指标的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与siRNA-control组比较，△P<0.05

3 讨论

帕金森是一种较常见的与年龄有关的神经退行性疾病，以黑质致密部的多巴胺能神经元的选择性缺失为特征，并引起身体震颠、僵硬和行动迟缓[1，8]。虽然具体的致病原因尚不清楚，但是有研究表明，氧化应激、线粒体功能紊乱、内质网应激及蛋白错误折叠都与该病密切相关[9-11]。提高神经细胞的抗氧化能力，保护其免受氧化应激而凋亡是研究热点之一。

6-OHDA是多巴胺的羟基化类似物，常被用作制作多巴胺能神经元变性模型[12]，它能够诱导多巴胺能神经元的ROS依赖性细胞凋亡[13，14]。本实验中，SH-SY5Y细胞经100 μmol/L的6-OHDA处理后，出现较高的凋亡率，表明成功制造出帕金森性神经损伤模型，为后续实验做好了基础。

真核细胞主要的凋亡传导通路有：死亡因子及其受体介导的外部传导途径、线粒体凋亡途径、内质网途径和B粒酶凋亡途径[15]。热点涉及p53蛋白、caspase蛋白家族和Bcl-2蛋白家族。6-OHDA可诱导细胞产生p53依赖性凋亡[14]，在细胞凋亡过程中，caspase-3和caspase-9被活化[16，17]，并可以裂解Bcl-2，Bax含量升高[18]。

PALM3在膜蛋白的运输或者靶向等方面有重要作用，并参与信号转导[5]。陈旭昕等[19]的研究表明，干扰PALM3表达，可缓解LPS诱导的肺泡上皮细胞的炎性反应。PALM3在保护细胞降低凋亡方面有重要作用。本实验通过RNA干扰技术，敲低了SH-SY5Y 细胞中PALM3的表达，经6-OHDA处理后，细胞凋亡数量、ROS含量、LDH、p53、Bcl-2、Bax以及活化的caspase-3、caspase-9较模型组显著减少；而细胞内GSH含量显著增加。以上实验结果表明，敲低PALM3后，SH-SY5Y 细胞降低了对6-OHDA诱导的应激，减少了凋亡。

综上所述，干扰SH-SY5Y细胞中PALM3表达，可显著减轻6-OHDA诱导的细胞毒性作用，可能是由于PALM3表达的减少，抑制了p53表达进而抑制细胞凋亡的caspase通路从而减轻了细胞损伤。