伍启康，李小燕，吴奎海，李炜煊△

1.广东省佛山市第一人民医院检验科，广东佛山 528000；2.广州医科大学第四附属医院检验科，广东广州 510182

阴沟肠杆菌作为条件致病菌，已成为医院感染的重要病原菌，可引起呼吸道、伤口、泌尿系统的感染和脑膜炎等疾病。随着广谱抗菌药物的广泛使用，耐碳青霉烯类药物的肠杆菌科细菌(CRE)不断增加，给临床治疗和医院感染控制带来了严峻的挑战。CRE主要的耐药机制是产生碳青霉烯类水解酶[1]。与此同时，Ⅰ类整合子和插入序列如共同区1(ISCR1)在耐药基因水平转移中起着重要的载体作用[2-3]。本研究主要调查佛山市第一人民医院(以下简称“本院”)分离阴沟肠杆菌的临床分布、耐药率、碳青霉烯酶表型及其耐药基因产生情况，为医院感染的诊断和治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1材料 选择2015年1月至2017年12月本院检验科微生物室分离的16株阴沟肠杆菌为研究对象。标本来源：痰液12例，尿液2例，血液2例，剔除同一患者同一部位重复分离菌株。

1.2仪器与试剂 PCR扩增仪器(德国Eppendorf公司)；凝胶仪(Bio-Rad公司)；TaqDNA聚合酶﹑dNTPs、DNA Marker、细菌基因组DNA提取试剂盒均为TaKaRa公司产品。利用法国生物梅里埃公司的VITEK2-Compact仪器及其配套GN进行细菌鉴定和药敏试验。采用AST-GN13卡进行菌种鉴定和药敏试验，采用K-B法进行补充药敏试验，药敏纸片购自英国OXOID公司。根据2015年美国临床实验室标准化委员会(CLSI)标准判断结果，入选标准为亚胺培南耐药的阴沟肠杆菌，即最低抑菌浓度(MIC)≥4 μg/L或K-B法折点≤19 mm；质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.3方法

1.3.1改良Hodge试验表型筛查 依据CLSI M100-S23进行改良Hodge试验。在生理盐水中配制0.5麦氏标准浊度的大肠埃希菌ATCC25922，用生理盐水1∶10稀释并涂布至M-H 平板，在平板中央贴上10 μg厄他培南药敏纸片，从药敏纸片边缘向平板边缘划待测菌，35 ℃孵育过夜，在被测菌株划线与大肠埃希菌抑菌环交叉处细菌有增强生长的趋势为阳性，即产碳青霉烯酶。

1.3.2乙二胺四乙酸(EDTA)协同试验 配制0.1 mol/L EDTA-Na2，加10 μL至美罗培南(MEM)纸片上，无菌条件下自然干燥备用。配制成0.5麦氏浊度的菌悬液，均匀涂布于MH琼脂平板，将MEM和MEM-EDTA-Na2的纸片贴于琼脂表面。结果判断：含酶抑制剂纸片与单药纸片的抑菌圈直径相差≥5 mm，提示该菌产生金属 β-内酰胺酶[4]。

1.3.3PCR扩增 细菌的DNA提取参考试剂盒说明书，-20 ℃保存。相关基因的PCR反应体系均为20 μL，其中含Mg2+的10×buffer 2 μL，dNTP 200 μmol/L，上下游引物0.2 μmol/L，DNA模板1 μL，TaqDNA聚合酶1 U，加入灭菌去离子水至20 μL。blaIMP、blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaOXA-48等碳青霉烯酶阳性菌株由广州医科大学第四附属医院微生物室提供，具体引物序列见表1。

表1 PCR反应的引物序列

1.3.4PCR产物序列分析 得到的PCR产物加入1.5%琼脂糖凝胶，电压为120 V，电泳时间40 min，最后经溴化乙锭染色20 min后在凝胶成像系统上观察结果，阳性产物送华大基因科技公司进行纯化并双向测序，利用DNAstar软件对测序结果进行序列校正，得到的序列与GenBank中序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行对比分析，确定基因亚型。

1.4统计学处理 采用Microsoft Excel2010对数据进行整理分析。

2 结 果

2.1药敏试验 16株阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗菌药物，第三代、第四代头孢菌素均耐药，对氨曲南、阿米卡星、左氧氟沙星耐药率分别为93.8%、31.2%、56.3%。见表2。

2.2碳青霉烯酶表型检测 16株阴沟肠杆菌改良Hodge试验和EDTA协同试验均阳性，分别提示16株菌株产碳青霉烯酶和产金属β-内酰胺酶。

2.3PCR分析 14株携带blaNDM-1基因，2株携带blaIMP-4基因，其余3种碳青霉烯酶基因均未检出。16株ISCR1、Ⅰ类整合酶和Ⅰ类整合子基因盒均阳性，见表3。

表2 16株阴沟肠杆菌药敏试验结果

注：CRO为头孢曲松；CAZ为头孢他啶；FEP为头孢吡肟；ATM为氨曲南；IMP为亚胺培南；MEM为美罗培南；AK为阿米卡星；LEV为左氧氟沙星；S为敏感；R为耐药。

表3 16株阴沟肠杆菌相关耐药基因分布

注：+为阳性；-为阴性。

3 讨 论

碳青霉烯类抗菌药物是治疗革兰阴性杆菌感染，特别是肠杆菌科细菌感染效果最好的β-内酰胺类药物，一旦碳青霉烯类药物耐药，临床治疗此类菌株感染将面临极大困难。本研究显示，耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌对氨基糖苷类、氟喹诺酮类抗菌药物有一定敏感性。由于氨基糖苷类抗菌药物具有较强的肾毒性和耳毒性，使用该药时应慎重。在临床治疗此类感染时，应根据药敏结果选择中介或者敏感的抗菌药物联合用药，如多黏菌素B或替加环素联合碳青霉烯类抗菌药物。阴沟肠杆菌耐药机制十分复杂，多种耐药机制可协同作用，造成阴沟肠杆菌出现耐药水平高及多重耐药的现象。目前阴沟肠杆菌产碳青霉烯酶以A类KPC-2为主，B类和D类少见。但本院的耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌均产金属β-内酰胺酶，78.5%(14/16)为携带blaNDM-1基因，携带blaIMP-4基因仅发现2株。差异存在的原因可能与各地区间抗菌药物使用情况以及地区环境不同所致。赵岐刚等[10]对64株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌进行研究，发现29株携带IMP-4基因，35株携带IMP-8基因，未检出VIM、OXA-48、NDM基因。在我国，NDM-1基因在鲍曼不动杆菌检出率较高，在肠杆菌科细菌中报道病例较少，由于该基因常位于接合型质粒上，在不同菌株之间易发生水平转移。LIU等[11]对11株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌进行研究，其中8株NMD-1阳性，仅2株IMP-4阳性。8株NDM-1基因上游均含有转座元件ISAba125，可能来源于鲍曼不动杆菌。近年来，有关肠杆菌科细菌携带blaIMP-4的报道逐渐增加，HU等[12]对中国5所教学医院分离到的51株CRE进行检测，发现blaKPC-2、blaNDM-1、blaIMP-4阳性率分别为54.7%、17.6%、11.8%。可见，我国不同地区CRE携带的碳青霉烯酶基因有所差异。但SIDJABAT等[13]发现，29株耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌均携带blaIMP-4基因；同时，DU等[14]在1例长期住院患者中先后分离出耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌和大肠埃希菌，且HI2质粒携带的blaIMP-4基因在两者之间传播。

改良Hodge试验是CLSI推荐的碳青霉烯酶表型检测方法，本研究通过改良Hodge试验进行了菌株的表型检测，结果均为阳性，并以EDTA协同试验检测金属酶，通过PCR检测证实菌株的产酶类型为属于Ambler 分类中的产碳青霉烯酶和产金属β-内酰胺酶，但可能存在其他耐药机制如细菌外膜蛋白、AmpC 酶缺失或菌株携带且高表达超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)等，需进一步通过基因扩增或耐药菌基因组测序来探讨，这亦为本课题组下一步工作。

Ⅰ类整合子、ISCR1为可移动的遗传元件，在细菌耐药的水平传播中起着重要作用。Ⅰ类整合子在整合酶的作用下，可以捕获外来的耐药基因，并在位于整合子上游的启动子的作用下得到表达，从而获得积累多重耐药性的属性。ISCR1以滚环形式转座临近的耐药基因，并提供启动子，常参与构建复杂性Ⅰ类整合子构成。DU等[14]发现，携带blaNDM-1基因的阴沟肠杆菌Ⅰ类整合子和ISCR1阳性，基因盒类型为dfrA12-aadA2。SIDJABAT等[13]发现，携带blaIMP-4基因的阴沟肠杆菌Ⅰ类整合子和ISCR1也为阳性，基因盒类型为blaIMP-4-aacA4。本研究发现16株均检测到Ⅰ类整合子和ISCR1，这些都加剧了多重耐药性细菌的播散。此外，16株细菌扩增出基因盒内两种基因型组合分别为dfrA17-aadA5、dfrA15-aadA2。本研究下一步工作将放在耐药菌接合转移实验和同源性分析，进一步验证碳青霉烯酶耐药基因的水平转移能力及是否存在克隆性传播现象。

综上所述，CRE的耐药情况较为严重，本院耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌以携带blaNDM-1的碳青霉烯酶耐药基因为主。临床工作中，需要加强对耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌耐药性的检测，规范抗菌药物的使用；同时，加强医务人员对CRE等多重耐药菌感染的预防和控制。