张胜忠 胡晓辉 杨 珍 徐 胜 郭进涛 侯 刚 张智猛苗华荣*陈 静*

(1.山东省花生研究所,山东 青岛 266100;2.安徽省农业技术推广总站,安徽 合肥 230001;3.新郑市和庄镇农业服务中心,河南 郑州 451150;4.铁岭市农科院,辽宁 铁岭 112616)

花生(ArachishypogaeaL.,2n=4X=40)是我国重要的油料作物和经济作物,常年种植面积约5×106hm2,总产1.6×1010kg左右,花生高产、稳产对保障我国植物油脂和蛋白的安全供给具有重要意义。花生籽仁产量,受荚果产量和出仁率影响。出仁率是花生单株产量的直接决定因素之一[1-2],是影响花生制品脱壳加工的重要经济指标[3]。开展出仁率相关基因/QTL 定位和分子标记辅助选择(marker assisted selection,MAS),对揭示花生出仁率遗传机制和开展花生高产分子育种具有重要意义。

在花生产量相关性状的研究中,多数集中于荚果或种子大小和种子质量[4-6]。近年来,国内外在花生出仁率相关基因/QTL定位方面也取得一些进展。Faye 等在不同水分胁迫条件下利用TAG 24×ICGV 86031 杂交衍生重组自交系群体定位到2个出仁率相关QTL,表型变异贡献率(phenotypic variation explained,PVE)为5.74%～6.97%[7]。Huang等利用一个F2:3群体,定位到3 个 出 仁 率 相 关QTL,qKPA5、qKPA7 和qKPA9,PVE范围为2.00%～11.78%[8]。蔡岩等利用远杂9102×徐州68-4杂交衍生的RIL 群体构建了包含365 个SSR 标记的连锁图,基于2年出仁率表型数据,检测到22个QTL,其中包括4个主效QTL[3]。Luo等利用830个标记和4年RIL群体出仁率数据,定位到25 个QTL,其中cqSPA9在4个环境下均稳定表达,表型贡献率为10.47%～17.01%[9],利用QTL-seq明确了qSPA9的基因组区间为66.75～69.50 Mb[10]。陈伟刚等检测到2 个出仁率主效QTL,qSPA5和qSPA9.1,其中qSPA9.1位点可以同时调控花生出仁率和株高[2]。Jiang等利用花生核心种质,通过关联分析在3个环境中分别检测到5个、2个和2个控制出仁率的等位基因,解释表型变异范围1.43%～2.98%[11]。总体而言,花生出仁率相关QTL 研究依然不足,特别是稳定主效位点较少,仍然需要定位和挖掘新位点。

随着花生栽培种的基因组序列陆续公布[12-14],以栽培种花生基因组为参考,进行相关基因/QTL定位与相关分子标记开发将更加准确和有效。本研究以花育36号×6-13杂交衍生的181个F2:9代重组自交系为试验材料,基于2个环境下出仁率表型数据进行QTL定位分析,为后续相关基因精细定位和分子育种改良出仁率性状提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以花育36号×6-13构建的重组自交系群体(F2:9)为试验材料,该群体包含181 个家系。母本花育36号为高产优质抗逆大花生品种,出仁率较高;父本6-13为高油品系,出仁率较低。

1.2 田间种植

2019年将试验材料分别种植于山东省花生研究所试验基地(E1:120.53°E,36.86°N)和山东省东营市黄河三角洲现代农业试验示范基地(E2:118.49°E,37.46°N)。种植方式为起垄双行单粒覆膜播种,垄距85 cm。每个家系种植1行,每行种植10株,株距15 cm,每隔20行(即10垄)种植1垄亲本(父、母本各1行),设3次重复。田间水肥管理等同于常规大田,及时进行病虫害防治。成熟后及时收获晾晒,选择每个家系中间8株用于荚果出仁率检测。

1.3 出仁率测定和数据处理

分别测定亲本和RIL 群体各家系成熟荚果质量和籽仁质量,计算出仁率,每个家系至少测定3次重复,取平均值。荚果出仁率计算公式:KP=KM/PM×100%,其中KP代表出仁率(kernel percentage),KM 代表籽仁质量(kernel mass),PM 代表相应荚果质量(pod mass)。

利用SPSS软件(IBM®SPSS®statistics 19)获得群体出仁率平均值、标准差、最小值、最大值、偏度、峰度,利用QTL IciMapping V4.1[15]进行方差估算,用于广义遗传率的计算。广义遗传率计算公式:h2=σg2/(σg2+σge2/n+σε2/nr),其中h2代表广义遗传率,σg2代表基因型方差,σge2代表基因型与环境互作方差,σε2代表误差方差,n代表环境数,r代表单一环境下重复数。

1.4 QTL定位

本实验室前期基于该RIL群体构建了一张高密度SLAF-seq遗传图谱,共包含3866个SNP和SSR标记,覆盖20个连锁群,总图距1266.87 cM[16]。利用QTL IciMapping V4.1软件,采用完备区间作图法对出仁率相关QTL进行定位分析。采用该软件BIP功能模块,定位单环境下相关QTL,以LOD大于3作为存在阈值,加性效应的正和负代表增效等位基因分别来自6-13和花育36号。采用该软件MET功能模块,定位多环境下相关加性和上位性QTL,分别以LOD大于3和5作为存在加性QTL和上位性QTL的阈值。主效应QTL的命名规则为:q+性状(kernel percentage,KP)+染色体数。上位性QTL的命名规则为:eq+性状(kernel percentage,KP)+染色体数+同一染色体上的次序。

2 结果与分析

2.1 亲本和群体出仁率表型分析

在E1、E2两环境下,母本花育36号的出仁率分别为79.62%和75.04%,父本6-13的出仁率分别为61.84%和55.63%,亲本间出仁率相差至少10个百分点,存在显著差异(表1)。在E1环境下,RIL群体出仁率变异范围为42.53%～84.88%,在E2环境下变异范围为41.15%～85.25%,两个环境下均存在广泛的遗传变异,且表现为超亲遗传(图1,表1)。方差分析表明,基因型、环境、基因型与环境间互作均能显著影响表型变异,广义遗传率为0.79(表2),由此可见,出仁率性状主要受遗传因素影响,但环境因素也不可忽略。

2.2 单环境分析定位出仁率QTL

采用复合区间作图法,结合2个环境表型数据,定位出仁率相关QTL。基于QTL IciMapping V4.1软件的BIP功能模块进行单环境QTL定位分析,在2 个环境下共检测到6 个主效应QTL(main-effect QTL),分布于第7、8、9、13、16、18连锁群上,表型贡献率为4.20%～15.14%(图2,表3)。在E1环境下,检测到3 个QTL,分别为qKP7、qKP9和qKP13,LOD值范围3.04～7.68,PVE范围5.49%～15.14%。在E2环境下,检测到5个QTL,分 别 为qKP7、qKP8、qKP9、qKP16 和qKP18,LOD值范围3.50～11.15,PVE范围4.20%～14.41%。其中qKP7 和qKP9 在两个环境下稳定表达,且qKP7 为主效QTL(major QTL,PVE＞10%),增效等位基因分别来自亲本6-13和花育36号 (表3)。

图1 RIL群体出仁率性状表型Fig.1 Phenotypic distribution of the kernel percentage in the RIL population

表1 亲本和RIL群体荚果出仁率表型统计Table 1 Statistics of kernel percentage in parents and the RIL population

表2 RIL群体荚果出仁率性状方差分析Table 2 Analysis of variance (ANOVA) for the trait of kernel percentage in the RIL population

2.3 多环境联合分析定位出仁率QTL

图2 不同环境下出仁率相关QTL定位Fig.2 QTL mapping for kernel percentage in different environments

表3 单环境分析定位出仁率QTLTable 3 QTL identification for kernel percentage by individual environment analysis

表4 多环境联合分析定位出仁率相关QTLTable 4 QTL identification for kernel percentage by multi-environmental joint analysis

为分析QTL 加性效应、加性与环境的互作效应对出仁率影响,采用QTL IciMapping V4.1软件的MET 功能模块进行多环境联合分析。由表4可以看出,共检测到6个加性QTL,分别为qKP7、qKP8、qKP9、qKP13、qKP16和qKP18,PVE范围为2.91%～15.82%。加性效应对表型的总贡献率为38.57%,加性QTL与环境互作对表型总贡献率为4.13%(表4),可见加性效应对出仁率遗传起主要作用。其中qKP16与环境互作对表型贡献率相对较大,为2.13%,表明该位点的表达易受环境影响。基于区间侧翼标记物理位置,发现这些QTL 的区间大小范围为0.46～6.00 Mb,其中主效位点qKP7物理区间仅0.60 Mb,有助于后续进行对该位点的精细定位和候选基因的鉴定。

2.4 出仁率相关上位性互作分析

为分析上位性互作对出仁率的影响,利用QTL IciMapping V4.1软件的MET 功能模块进行上位性QTL检测。由图3和表5可以看出,共检测到6对上位性QTL,共涉及10个位点,分别位于第3、7、11、12、15、16、17、18染色体,LOD 值的范围为5.18～6.30,上位性互作对表型变异贡献率为2.90%～4.58%。其中,eqKP11.1 与eqKP13之间的互作效应对表型变异贡献率最大,为4.58%;eqKP11.2与eqKP18之间的互作效应对表型变异贡献率最小,为2.90%。位点eqKP7和eqKP11.2均分别与2 个不同基因组位点存在上位性互作。上位性位点eqKP7(Marker4243-Marker4263) 与加性位点qKP7(Marker4240-Marker4243)区间存在重叠,可能是同一位点。另外,发现部分上位性QTL 与环境间存在互作,总贡献率为0.49%(表5),表明基因间互作对出仁率调控受环境影响较小。

图3 出仁率性状相关上位性QTL分析Fig.3 Analysis of epistatic QTL associated with kernel percentage

表5 出仁率相关上位性QTL定位Table 5 Epistatic QTL identification for kernel percentage

3 讨论与结论

本研究中花育36号和6-13的出仁率性状存在显著差异,表明两亲本调控出仁率的遗传基础存在差异。RIL群体在2个环境下均存在广泛的遗传变异,表现为超亲遗传,表明来自双亲的等位基因在RIL群体中发生了充分的基因重组,这不仅有助于后续QTL 定位分析,同时有助于培育出仁率性状优良的品系/品种。前人研究表明出仁率属于数量性状,遗传机制复杂,易受环境影响[2-3]。本研究中出仁率的广义遗传率为0.79,表明出仁率性状主要受遗传因素影响,但环境因素也不可忽略。

本研究共检测到6 个主效应QTL,其中qKP7和qKP9在2个环境下稳定表达,物理位置分别为0.21～0.81Mb和101.75～107.75Mb(表4)。qKP7 为主效位点,对表型变异贡献率较大(PVE＞10%),qKP7与环境互作效应较小(PVE=0.13%),因此该位点可作为后续基因精细定位和分子聚合育种的‘靶标’位点。Luo等在第9染色体上定位到一个稳定主效位点cqSPA9,物理区间为66.75～69.50 Mb[9-10],与本研究中qKP9物理位置相距较远,推测两者不是同一位点。Huang等在第7和第9连锁群上检测出仁率相关QTL,qSPA7(PVE=11.78%)和qSPA9(PVE=2.00%)[8]。陈伟刚等在第9连锁区也定位到一个控制出仁率的稳定主效位点qSPA9.1,PVE范围为11.72%～14.79%[2]。由于无法明确这些位点在花生栽培种基因组的位置及缺乏共有标记,因此难以与本研究的定位结果相比较。除稳定表达的qKP7和qKP9位点外,本研究还检测到一些环境特异表达的位点,如qKP16,其与环境互作效应对表型贡献率达2.13%,这解释了出仁率易受环境影响的现象。

复杂性状的基因表达往往存在上位性作用,单纯主效应QTL 定位不能真实反映QTL 对性状的调控效应[2,17-18]。本研究共定位到6对上位性互作QTL,共涉及10个位点,其中eqKP7和eqKP11.2均分别参与2对上位性互作,表明花生出仁率遗传存在复杂的分子调控网络。另外,比较上位性QTL 和加性QTL 定位结果,发现eqKP7与qKP7区间存在重叠,表明该位点不仅可以直接调控花生出仁率,也可与其他位点互作影响该性状。传统的MAS往往针对效应较大位点进行选择,本研究中上位性互作以及微效QTL对表型贡献率较小,不满足实现MAS的要求,对此可采用基因组选择策略(genomic selection,GS)[19],即考虑全基因组标记对性状的遗传效应,从而实现对微效位点的利用。

本研究基于RIL群体2个环境下表型数据,鉴定了6个出仁率相关主效应QTL 和6对上位性位点,明确了不同遗传效应对花生出仁率性状的影响,为后续花生高产分子育种研究提供了重要基础。