冯春艳，梁琼，赵晓野，王儒，王婷

海南省食品药品检验所海口分所（海口 570311）

贝类在生长过程中，位置相对固定，因其具有非选择性滤食习惯[2]，容易受到海洋环境中农兽药残留、重金属、生物毒素的污染。胡蓉等[1]在海南岛近岸海域贝类中的腹泻性贝类毒素的研究中发现海南岛海域贝类毒素的腹泻性毒素超标率高达33.68%，而广东省也曾发生过因使用有毒贝类引起消费者中毒和死亡的事件[3]。海南是沿海省份，贝类产品的人均食用量大，发生食用贝类产品中毒的概率大大增加，近年来海南贝类养殖规模不断扩大，关于海南岛海域赤潮的报告也不断增加[4]，这说明海南贝类养殖的食用安全存在较大风险。因此，人们对贝类食用安全性的关注度日益升高。主要对贝类毒素研究过程中毒素的分类、贝类毒素作用机理及中毒表现、贝类毒素的高发季节、贝类毒素常用检测方法等方面进行阐述。

1 贝类毒素的分类

贝类毒素具有突发性和广泛性，是危害较大的海洋毒素之一。根据其毒性作用机制可分为麻痹性贝类毒素（PSP）、腹泻性贝类毒素（DSP）、神经性贝类毒素（NSP）和健忘性贝类毒素（ASP）四大类。由于其毒性大、反应快、无适宜解毒剂，四类毒素均无特效治疗药。

2 贝类毒素作用机理及中毒表现

麻痹性贝类毒素（PSP）是一类剧毒的含氯杂环有机化合物，毒性与河豚毒素相当，一些赤潮生物种，如甲藻类中的亚历山大藻、膝沟藻属、原甲藻属等是PSP的直接生产者。根据基团的相似性，可分为氨甲酰基类毒素（Carbamoyl toxin）、氨甲酰基-N-磺基类毒素（N-Sulfo carbamoyl toxin）、去氨甲酰基类毒素（Decarbamoyl toxin）三大类。其主要是通过对细胞钠通道的阻断，造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用。中毒的主要症状为口唇刺痛和麻痹，并扩散至面部、脖子、肢端，伴有头痛、晕眩、呕吐、腹痛、腹泻等，严重者会停止呼吸、窒息死亡。

腹泻性贝类毒素（DSP）是聚醚或大环内酯化合物，具有脂溶性，主要来自于自于鳍藻属（Dinophysis）、原甲藻属（Prorocentrum）等藻类。DSP由软海绵酸及衍生物鳍藻毒素-1与鳍藻毒素-3、扇贝毒素（大环内酯化合物栉膜毒素）、硫化物毒素三种不同的聚醚化合物组成。其主要作用机制是通过激活肠道细胞内环磷酸腺苷（cAMP）介质系统而引起水泻[5]。中毒的主要症状是恶心、呕吐、腹痛、腹泻等，中毒症状可能会持续3 d，不会留下后遗症，更不会致命。

神经性贝类毒素（NSP）为多环聚醚化合物，高脂溶性，主要来自于短裸甲藻。其主要作用机制与麻痹性毒素相似，作用于钠通道，但其作用位点与石房蛤毒素不同，引起钠通道维持开放状态，从而引起钠离子内流，造成神经细胞膜去极化。中毒的主要症状为肌关节无力、冷热感觉颠倒、说话吞吐困难等。

健忘性贝类毒素（ASP）主要来自于软骨藻酸。其作用机制是作用于中枢神经系统红藻酸受体，导致去极化、钙的内流以及细胞的死亡。中毒的主要症状是头晕、眼花、短期记忆功能丧失。

3 贝类毒素的高发季节

季节的不同，海水水体温度、光照条件、pH、海水盐度等环境因素变化，进而影响藻类种群、数量和贝类的生理状态。PSP与DSP的高发季节为秋末和冬季[6]。据文献表明，南海中部浮游甲藻密集且主要存在海南岛东南部[7]，产PSP的亚历山大藻在15～20 ℃的低温下生长较好，且细胞毒力较强[8-9]，因此甲藻在冬季数量激增，为贝类提供了丰富的食物资源，这可能是秋冬季海南岛近岸贝类体内PSP含量增多的主要原因之一，这与李政菊等[6]关于海南岛近岸海域贝类中的麻痹性贝类毒素的研究显示的海南岛近岸海域养殖的主要贝类体重PSPDE检出率为62.5%结论一致。还有研究表明，海南岛近岸DSP阳性检出率和超标率的最低值均出现在夏季，最高值均出现于冬季[1]。有利玛原甲藻和D. caudata等是目前已被确定产生DSP的毒藻，海南岛海域大量存在有利玛原甲藻和D.caudata，且浮游植物细胞密度呈在冬季初期最高，秋季次之，夏季最低的趋势[10]，这与胡蓉等[1]的研究DSP检出率达46.32%，超标率达33.68%，且呈冬季最高，夏季最低的结论相一致。由于秋末冬初海水温度、pH、海水盐度等条件适宜，为有毒藻类的繁殖提供有利的条件，因此夏末至冬季这一时间段为研究海南岛近岸贝类PSP和DSP的重点监测期。

4 贝类毒素常用检测方法

4.1 小鼠生物测定法

小鼠生物测定法是将贝类样品的酸性提取液注射到体质量约为20 g的小鼠腹腔中，在24～48 h内观察小鼠的病理效应。该方法均可用于ASP、DSP、NSP、ASP的检测，使用“鼠单位”（Mu）表达，一个鼠单位（Mu）指一只20 g体质量的小鼠在腹腔注射后15 min内死亡的毒素最小剂量，PSP的检出限为4 Mu/g，DSP的检出限为0.05 Mu/g[11]

该方法检验技术容易掌握，不需要大型精密的仪器和专门的操作人员，被美国分析化学家协会（AOAC）确定为检测PSP的标准方法[11]，但该方法只能确定毒素的有无和大小，不能确定样品中毒素的成分和结构并准确定量；且小鼠的死亡时间受小鼠的个性特征、实验室的饲养条件、实验人员操作技术、样品基质如游离脂肪酸等内源性化合物的影响，导致该方法特异性不高，易出现假阳性结果；此外，小鼠活体实验在道德伦理上受到动物保护主义者的反对，目前很多国家已逐步禁止使用该方法。

4.2 酶联免疫分析法

酶联免疫分析法以抗原抗体特异性反应为基础，将毒素与酶连接，酶与底物发生显色反应，通过分析特定波长的吸收强度对毒素进行定性定量分析。主要包括放射免疫分析（EIA）法、酶联免疫吸附（ELISA）法和竞争性酶免疫分析（EIA）法三种。目前很多公司已经研制出酶联免疫吸附检测试剂盒并被广泛应用，其检测贝类毒素的检出限甚至低至ng/g级，如DSP检测限为0.1 ng/g、PSP检测限为0.02 ng/g、NSP检测限为0.01 ng/g、ASP检测限为0.5 ng/g[11]。

酶联免疫法具有灵敏度强、特异性高、检测用样少、操作简单等特点，不需要大型仪器设备和专门操作人员，适用于大批量样本的分析，近年来在海洋生物毒素的快速检验中得到广泛应用。但酶联免疫法也有一定的缺陷，例如贝类毒素种类繁多，而目前用于检测贝类毒素的商品化检测试剂盒种类不全，且免疫反应不是针对毒素结构，而是根据毒素结构的表位进行定性定量，因此对于生物基质复杂的毒素，有存在交叉反应、试验结果重现性差的风险。此外，由于商品化试剂盒价格较昂贵，在一定程度上也限制其推广使用。

4.3 高效液相色谱-荧光检测法

高效液相色谱-荧光检测法包括柱前衍生反应法和柱后衍生反应法，其原理是利用合适的溶剂提取出样品中的待测物质，加入衍生化试剂使待测物发生衍生化作用并在一定波长激发光的照射下产生荧光，通过分析荧光的吸收强度对待测物质进行定性定量。该方法可用于几乎所有贝类毒素的检测，是目前国内外检测PSP和DSP常用的方法之一[12]，PSP的检测低限甚至达到了6.5～129 μg/kg[11]。

该方法检测时间较小鼠生物测定法短，具有灵敏度高、检测范围广，能够完成大批量的检测任务等优点，但由于同系贝类毒素结构相似、保留时间基本相同的特点，高效液相色谱-荧光检测法对同系毒素的定性能力较差。另外，由于在检测过程中用到的衍生化试剂也比较昂贵，部分荧光试剂不稳定，需要现用现配等原因，使该方法的使用也受到一定的限制。

4.4 液相色谱-质谱联用法

液相色谱-质谱联用法是目前贝类毒素检测中最有优势的一种分析方法，将液相色谱的分离技术与质谱的分析技术有效结合起来对毒素的化学成分和结构进行分析。GB 5009.213—2016第四法液相色谱-质谱联用法中PSP的检出限为25.0～50.0 μg/kg[13]；GB 5009.212—2016第三法液相色谱-质谱联用法中DSP检出限为10.0 μg/kg[14]；GB 5009.198—2016第三法液相色谱-质谱联用法中ASP检出限为0.005 μg/kg[15]。

液相色谱-质谱联用法不需要实现待测物质与干扰组分的完全色谱分离，即可提供待测物质的结构信息。其具有分析速度快、检出限低、选择性好、稳定性好、抗干扰能力强、定性定量结果准确等优点，使得该方法在贝类毒素检测中发展迅速。目前，该方法已收录至国内的国家标准方法中[13-15]，该方法具有定性和筛查未知物的能力，对新型毒素的发现和验证有广阔的发展前景。缺点是液相色谱-质谱联用仪价格昂贵且需要专业的技术人员，检测成本高。

5 结语

我国是贝类养殖大国，近年来由于赤潮出现频繁，贝类毒素严重影响着贝类的食用安全和商品出口。目前针对贝类毒素的研究已经引起人们的广泛关注。建议加强对有毒藻类的类型、贝类养殖水域的质量状况、贝类毒素高发季节的影响因素和贝类毒素的检测方法进行综合性的研究，以确保贝类产业的健康发展。

海南岛是我国的第二大岛，仅次于台湾。丰富的海洋资源和得天独厚的生态环境为热带贝类养殖提供了有利条件。贝类养殖作为海南海产养殖的重要产业，其产业的健康发展关系着海南岛蓝色经济带的建设。随着近年来该海域有毒赤潮的不断发生，该海域养殖贝类的食用安全存在较大风险，但关于海洋毒素在海南岛贝类中染毒状况的研究却非常少见[5]。这样不利于海南省日常监测工作的展开和贝类养殖业的可持续发展，为了保证水产品的食用安全性，减少食源性中毒的公共卫生突发事件，提高消费者的意识，急需了解贝类生物毒素污染状况，不同产地、不同季节、不同贝类品种间贝类生物毒素分布规律，进而为提高和改善水产品的质量及安全性提供参考依据。