陈益胜，黄彩虹，徐学明*

（江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）

治疗痛风的药物多以黄嘌呤氧化酶为靶向[1]。不过，常见化学药的使用伴随较为严重的毒副作用。有鉴于此，研究发掘更加高效低毒的黄嘌呤氧化酶抑制剂意义重大。很多具有传统药用历史的植物中含有丰富的活性物质，不仅效果好而且毒副作用低，是新型药物的宝库[1-4]。近年来的研究表明，橄榄叶提取物中的活性成分对黄嘌呤氧化酶的抑制作用尤其明显。本研究以薄层色谱为平台，联用黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤氧化反应，以反应产物 (尿酸)的紫外吸光特征变化为指标建立了一种效率高、可靠性好的黄嘌呤氧化酶活性抑制能力定量评价方法，并应用到橄榄叶提取物的非靶向活性评价。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

本研究所使用的试剂均为分析纯；黄嘌呤氧化酶：活性90μ/mg，中国国药集团；分析型硅胶板：青岛海洋化工；橄榄叶：市售；薄层色谱工作站。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

精确称取10mg别嘌呤标准品到10mL棕色容量瓶，甲醇定容得到1mg/mL标准储备液。用移液管吸取别嘌呤标准储备液0.5mL转移至10mL容量瓶，甲醇定容，得到0.05mg/mL标准工作溶液浓度。10g橄榄叶粉碎后与50mL提取液混合，30℃超声水浴 30min，取 2mL液体5000r/min离心5min；取上清液2mL，经0.45μm过滤，用甲醇适当稀释。称取100mg黄嘌呤氧化酶，溶于10mL磷酸缓冲液 (pH=7.8)中，得到酶溶液，使用前适当稀释。称取100 mg黄嘌呤，溶于10mL磷酸缓冲液中，得到底物溶液，使用前适当稀释。

1.2.2 色谱条件

用薄层点样仪将别嘌呤标准工作液和橄榄叶提取液以条带的形式吹扫到薄层板上。10cm×10cm薄层板上可以容纳10个条带，包括别嘌呤2个平行内标，核8个待测样液条带。色谱流动相：v（乙酸乙酯）/v（甲酸）/v（氨水）(7/3/0.5)，展开距离为70mm。

1.2.3 酶反应显色

将展开后的薄层板浸入黄嘌呤氧化酶溶液。取出后立即阴凉处避光静置5min；然后浸入黄嘌呤溶液；取出后阴凉避光静置反应10min。

1.2.4 光密度扫描测定

用光密度仪对经过生物显影的分离轨道进行扫描测定。仪器参数设置：反射—荧光模式，钨灯，激发光波长290nm，不用滤光片。光密度扫描结果通过工作站软件处理。

1.2.5 酶活抑制指数计算

按照公式（1） 计算2个别嘌呤平行内标斑点峰面积的平均值P标均

按照公式（2） 计算每个橄榄叶提取物样品轨道斑点峰面积P样

式中：i为酶活抑制斑点编号；n为酶活抑制斑点数量；Pi为第i个酶活抑制斑点峰面积。

按照公式（3） 计算2个橄榄叶提取物平行样品平均斑点峰面积P样均

按照公式（4） 计算橄榄叶提取物样品的酶活抑制指数EI

2 结果与讨论

2.1 检测参数优化

酶催化反应底物黄嘌呤和产物尿酸分别在265nm和290nm处有较强的紫外吸收。经过酶催化反应，在薄层板的背景区域，由于没有物质对酶催化活性进行抑制，大部分的黄嘌呤被转化为尿酸；而在有酶活性抑制物存在的斑点内，黄嘌呤-尿酸的转化过程被抑制，抑制效应在一定浓度范围内与抑制剂的浓度和种类高度相关且呈线性关系。考虑到样品中大量基质物质的特征紫外光吸收在250nm左右，选用尿酸的最佳吸收波长290nm作为光密度计入射光的波长，降低样品基质对测试结果的干扰。不过，由于薄层板的背景区域尿酸含量高，吸光度强，造成吸光光密度扫描得到的信号峰为倒峰，无法用软件对其进行积分。为了解决这一问题，我们将光密度检测模式改为荧光模式，激发波长设定为290nm，取消滤光片，使得光密度计的感应光纤能够接收相近波长反射光。这一变化可以有效避免倒峰信号对后续信号积分计算的影响。

2.2 显色条件优化

显色反应的发生必须由酶催化实现，因此酶的浓度对显色结果有重要影响。因此首先使用别嘌呤作为指示物，优化酶浓度。固定底物溶液浓度为0.1mg/mL，研究了0.01，0.02，0.04，0.06，0.08和0.1mg/mL 6个质量浓度梯度的酶溶液对显色效果的影响。结果表明，当黄嘌呤氧化酶质量浓度在0.01～0.08mg/mL范围内，内标物别嘌呤的信号峰面积随着黄嘌呤氧化酶浓度的上升而增高。进一步增加黄嘌呤氧化酶的质量浓度到0.1mg/mL，对应的峰面积没有明显上升，这可能是因为酶的反应催化能力在0.08mg/mL水平达到了最高点，因此固定使用0.01mg/mL的黄嘌呤氧化酶溶液作为显色用途。此后，研究了不同底物浓度对显色结果的影响。这里选取0.01，0.05，0.1，0.2和0.5mg/mL的黄嘌呤溶液作为底物参与反应。光密度扫描结果显示，在0.01～0.1mg/mL范围内，内标别嘌呤的峰面积随着底物浓度的上升而增高。进一步增加黄嘌呤质量浓度到0.1mg/mL不会引起内标峰面积的上升。而当黄嘌呤质量浓度增加到0.5mg/mL水平，内标峰面积反而下降，这可能是因为酶催化反应后多余的黄嘌呤残留引起了吸光特征的变化。由此，用于酶反应显色的底物溶液质量浓度选定为0.1mg/mL[5]。

2.3 酶抑制活性评价应用

随后将方法应用到5种橄榄叶样品的黄嘌呤氧化酶活性抑制能力的评价。为了方便定量比较，这里我们使用酶活抑制指数的概念来规范光密度扫描结果的计算。数据汇总结果如表1所示。很明显，对同一种橄榄叶样品来说，经过不同提取液得到的提取物的酶活抑制能力表现出显著的差异。总的来说，随着提取溶液极性的降低，提取物总的酶活抑制指数也下降，这可能是因为橄榄叶中具有酶抑制能力的成分通常是生物碱、多酚、黄酮等亲水化合物，因此在极性溶液中提取率更高。此外，我们可以看到橄榄叶提取物的酶活抑制能力也表现出显著的地区差异。地中海地区的橄榄叶提取物酶活抑制能力最高（6～7），广东次之 （4～5），云南最低 （＜4）。这说明必须慎重使用来自不同产地的橄榄叶作为黄嘌呤氧化酶抑制剂原料。这也从侧面证明了本方法的实际意义。

表1 橄榄叶样品酶活抑制指数测定结果

3 结论

本研究建立了一种高效可靠的橄榄叶提取物黄嘌呤氧化酶活性抑制评价方法。在方法建立过程中，重点研究了光密度检测参数、酶浓度、底物浓度和显色时间对方法优化的影响，同时提出了一种以抑制指数为定量评价计算方法的评价模式。本方法不仅可以避免提取物样品中背景基质对评价可信度的影响，同时也能消除相似活性物质的互相干扰，因此可以很好地替代目前常用的吸光光度法，极大地简化从天然产物中非靶向筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的过程。