吴 琴，郑传奎，李文兵，胡昌江，张彩虹

(四川新绿色药业科技发展有限公司，四川 成都 611900)

胡芦巴，又名芸香草、香豆草，为一年生豆科草本植物，为豆科植物胡芦巴Trigonellafoenum-graecumL.的干燥成熟种子，喜阴、耐寒，在我国分布于东北、西南及河北、陕西、甘肃、新疆、山东、江苏、安徽、浙江、河南、湖北、广西等地。胡芦巴具有温肾助阳、祛寒止痛的功效，常用于治疗肾脏虚冷、小腹冷痛、小肠疝气、寒湿脚气等[1-2]。胡芦巴中含有甾体皂苷类、黄酮类、三萜类、生物碱类、香豆素类、油脂类等[4-9]化合物，具有抗肿瘤[10]、抗氧化应激[11]、补肾壮阳、保护重要器官[12]等作用；同时胡芦巴中的纤维及甾体皂苷类成分还分别具有降血糖、降血脂作用[13]。

标准汤剂作为衡量中药配方颗粒与临床汤剂是否基本一致的基准物质，其质量控制是中药配方颗粒质量标准建立的重要一环。在前期文献[14-15]调研中发现，不同产地胡芦巴药材中所含成分种类及活性成分含量都存在着一定差异。这种由于原料差异而导致的药材质量不统一，不仅会间接影响着中药配方颗粒的质量稳定，还会对临床上用药的准确性造成干扰。因此，为减少药材产地带来的质量差异，本研究对4个不同产地的24批胡芦巴饮片进行标准汤剂制备及特征图谱研究，分析比较各个产地的胡芦巴质量差异，旨在鉴别胡芦巴产地和更好地控制胡芦巴标准汤剂及其配方颗粒的质量稳定，为不同产地胡芦巴标准汤剂的质量标准建立提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters Acquity H-class型超高效液相色谱仪(美国Waters科技有限公司)；Agilent 1260型高效液相色谱(HPLC)仪(美国安捷伦科技有限公司)；电子分析天平ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；超纯水机细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；超声波清洗器KQ5200DB型(600W，40kHz，昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料

牡荆素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111687-201704，纯度：94.9%)；异荭草苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111974-201401，纯度：94.0%)；胡芦巴碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110883-201604，纯度：78.4%)；24批胡芦巴标准汤剂(四川新绿色药业科技发展有限公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)；冰乙酸(色谱纯，成都市科隆化学试剂有限公司)；甲醇(分析纯，成都市科隆化学试剂有限公司)；水为超纯水。24批药材、饮片及标准汤剂信息见表1。

表1 24批胡芦巴饮片产地信息

2 方法

2.1 标准汤剂制备

取胡芦巴饮片100 g，加水煎煮2次，一煎加10倍水，浸泡30 min，煮沸，保持微沸煎煮60 min，200目筛网过滤，立即冷却至室温；二煎加8倍水，煮沸，保持微沸煎煮40 min，200目筛网过滤，合并两次水煎液，立即冷却至室温，浓缩、冷冻干燥，分装，即得。

2.2 胡芦巴碱含量测定

2.2.1 色谱条件 采用Waters Acquity H-class型超高效液相色谱仪，Agilent5 Tc-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-0.05%十二烷基磺酸钠溶液-冰醋酸(20∶80∶0.1)为流动相等度洗脱，检测波长为265 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为10 μL。

2.2.2 溶液制备 (1)供试品溶液制备：取本品粉末(过三号筛)约0.2 g，精密称定，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定重量，放置1 h，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)45 min，放冷，密塞，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(2)对照品溶液制备：取胡芦巴碱对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含60.0 μg胡芦巴碱的溶液，即得。

2.2.3 方法学考察(1)线性关系：取胡芦巴碱对照品溶液母液(59.68 μg/mL)，分别精密吸取对照品溶液2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、30 μL注入液相色谱仪，分析得到峰面积积分。以进样量(X，μg)为横坐标，峰面积积分(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为y=2E+06x+29880(R2=0.999)，可知胡芦巴标准汤剂线性范围为0.119 4～1.790 4 μg。

(2)精密度。取同一份胡芦巴碱对照品溶液，按照“2.2.1”项下条件连续进样6次，记录胡芦巴碱的峰面积，计算RSD值，结果RSD=0.42%<2.0%，说明该液相色谱仪的精密度良好。

(3)重复性。取供试品(批号：HLBBT180723)0.2 g，精密称定6份，由同一操作人员按照“2.2.2”项下的方法制成供试品溶液，按照“2.2.1”项下条件进样，计算6份供试品中胡芦巴碱的含量，结果RSD=1.41%<2.0%，表明本方法重复性良好。

(4)稳定性实验。取同一供试品溶液(批号：HLBBT1-80723)，分别于放置0 h、4 h、6 h、10 h、14 h、18 h、24 h后进样测定胡芦巴碱的峰面积。结果表明，在本实验条件下，胡芦巴碱峰面积的RSD值为0.97%<2.0%，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

图1胡芦巴标准汤剂中胡芦巴碱色谱

表1 加样回收试验结果

2.2.4 含量测定以24批胡芦巴标准汤剂冻干粉为供试品，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按照“2.2.1”项下条件进样测定，记录峰面积，计算胡芦巴碱的含量，结果见表3。

2.3 特征图谱建立

2.3.1 色谱条件 采用ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×50 mm)色谱柱，以乙腈-甲醇(3∶1)为流动相A，以0.2%冰乙酸溶液为流动相B，梯度洗脱(0～34 min，A：9.5%→13%；34～55 min，A：13%→30%；55～65 min，A：30%)，检测波长为339 nm，流速为0.3 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为1 μL。

2.3.2 溶液制备(1)供试品溶液制备。取本品约0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率600 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(2)参照物溶液制备。取牡荆素、异荭草苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含牡荆素30.0 μg、异荭草苷15.0 μg的溶液，即得。

2.3.3 方法学考察 (1)精密度。取胡芦巴标准汤剂(批号：HLBBT180723)冻干粉粉末，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3.1”项下方法连续进样6次，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果各特征峰相对保留时间的RSD在0.16%～2.16%之间，特征峰相对峰面积的RSD在1.92%～4.92%之间，表明该仪器精密度良好。

(2)重复性。取胡芦巴标准汤剂(批号：HLBBT180723)冻干粉粉末，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3.1”项下方法进样测定，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果各特征峰相对保留时间的RSD在0.11%～0.60%之间，特征峰相对峰面积的RSD在1.48%～8.07%之间，表明该方法重复性良好。

(3)稳定性考察。取胡芦巴标准汤剂(批号：HLBBT1-80723)冻干粉粉末，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别于放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、24 h时按照“2.3.1”项下方法进样测定。结果相对应的特征峰相对保留时间的RSD在0.24%～2.58%之间，特征峰相对峰面积的RSD为0.81%～9.25%，说明样品溶液在24 h内较稳定。

(4)特征图谱建立及相似度评价。取24批不同产地的胡芦巴标准汤剂粉末，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3.1”项下方法进样测定。采用中药色谱特征图谱相似度评价系统(2012版)软件对24批样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间、相对峰面积比值及相似度。

3 结果

3.1 含量测定结果

按拟定的方法对24批胡芦巴标准汤剂中胡芦巴碱的含量进行测定，结果见表3。4个产地胡芦巴标准汤剂中胡芦巴碱的含量范围为1.58%～2.12%，平均含量为1.85%。通过计算不同产地批次胡芦巴中胡芦巴碱含量的平均值可知，4个产地胡芦巴标准汤剂中胡芦巴碱含量并无明显差异。

3.2 特征图谱分析

利用中药色谱特征图谱相似度评价系统(2012版)软件对24批标准汤剂样品进行匹配，根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出峰且该峰相对较高的原则，共标定了10个重复性较好的峰作为特征共有峰，其相似度均大于0.95，结果见表4、表5。经过与对照品进行指认，确认2个峰，即峰10为异荭草苷，峰13为牡荆素，如图2所示。24批样品的特征图谱及其对照图谱见图3和图4，相对保留时间及其相对峰面积见表6和表7。

表3 24批胡芦巴标准汤剂含量测定结果

10-异荭草苷；13-牡荆素

图3 胡芦巴标准汤剂特征图谱

图4 胡芦巴标准汤剂对照特征图谱

表4 2批样品相似度评价结果

表5 12批样品相似度评价结果

续表5

样品相似度S13S14S15S16S17S18S19S20S21S22S23S24S180.9910.9900.9910.9921.0001.0001.0000.9991.0001.0001.0001.000S190.9910.9900.9910.9921.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000S200.9920.9920.9930.9931.0000.9991.0001.0001.0000.9990.9991.000S210.9920.9920.9920.9931.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000S220.9900.9900.9900.9911.0001.0001.0000.9991.0001.0001.0001.000S230.9890.9890.9890.9901.0001.0001.0000.9991.0001.0001.0001.000S240.9910.9900.9910.9921.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000R0.9590.9590.9590.9610.9830.9850.9830.9800.9810.9840.9860.984

表6 24批胡芦巴标准汤剂相对保留时间

表7 24批胡芦巴标准汤剂相对峰面积

续表7

批号峰5峰6峰8峰9峰10峰11峰13(s)峰14峰23峰24S230.141.060.611.221.780.531.001.190.470.17S240.131.020.601.191.740.471.001.150.460.15平均值0.110.620.591.081.520.491.001.170.320.12RSD(%)20.2672.8939.3043.8141.9530.09/2.0543.5926.39

通过对不同产地胡芦巴标准汤剂特征图谱进行对比分析发现，不同产地胡芦巴药材制备的对应标准汤剂所含化学成分差异较大，其中四川、安徽产地的胡芦巴标准汤剂化学成分一致，甘肃、河北产地的胡芦巴标准汤剂化学成分一致。除标定的峰5、峰6、峰8～峰11及峰13、峰14、峰23、峰24等10个共有峰之外，共计差异性成分峰11个，其中峰1～峰4，峰7、峰12、峰16等7个峰只存在于甘肃、河北产地的胡芦巴中，而峰15，峰17～峰19等4个峰也仅存在于四川、安徽两地的胡芦巴中，且部分峰的峰面积差异较大(如峰20、峰22等)，推测其相应的含量也存在一定差异。这可能与文献[14]报道的“由于产地的土壤、气候、海拔、植物生境等条件不同，使胡芦巴植物次生代谢过程存在一定差异，导致其不同产地胡芦巴药材化学成分不一致”的结果相同。

4 讨论

中药特征图谱在中药质量控制中占有重要地位，其能较全面地反映胡芦巴标准汤剂中的化学成分信息，通过对这些信息进行分析，可以对样本质量进行整体评估，该方法已成为研究中药标准汤剂以及中药配方颗粒的主要途径。

在本研究初期，笔者对流动相[甲醇-0.1%甲酸，乙腈-0.1%甲酸，乙腈-甲醇(3∶1)-0.1%甲酸、乙腈-甲醇(3∶1)-0.2%冰乙酸，乙腈-甲醇(3∶1)-0.1%磷酸，乙腈-甲醇(3∶1)-0.1%冰乙酸]，波长(360 nm、280 nm、254 nm、300 nm、339 nm)，柱温(25、30、35、40 ℃)，流速(0.20 mL/min、0.27 mL/min、0.30 mL/min、0.32 mL/min、0.40 mL/min)等色谱条件进行了考察。结果表明，以乙腈-甲醇(3∶1)-0.2%冰乙酸为流动相，在波长339 nm、柱温25 ℃、流速0.3 mL/min的条件下进行梯度洗脱时，供试品中色谱图的基线较稳且色谱峰的峰形、分离度均较好。在同一色谱条件下，对供试品溶液制备中的不同提取溶剂(水、50%甲醇、甲醇)和不同提取方式(超声、回流)进行考察。结果表明，50%甲醇作为提取溶剂时，所得色谱图的峰面积较大，分离度良好；回流和超声提取效果相差不大，为方便操作，选择超声作为胡芦巴标准汤剂的提取方式。

本文参考2015版《中国药典》，选择胡芦巴碱作为胡芦巴标准汤剂的指标成分。结果显示，不同产区的胡芦巴标准汤剂中胡芦巴碱含量相差不大，范围在1.58%～2.12%之间。同时，结合UPLC特征图谱分析得知，24批次不同产地的胡芦巴标准汤剂中所含化学成分既有相似性，也有差异性。在同一色谱条件下，共标定共有峰10个，其中四川、安徽两产地与甘肃、河北产地的胡芦巴标准汤剂中差异性成分共计11个。通过建立UPLC特征图谱可快速、直观、有效地鉴别出胡芦巴的产区，结合指标成分定量研究，为胡芦巴标准汤剂的内在质量控制提供了参考依据，同时为建立胡芦巴配方颗粒的质量标准提供了更加全面的研究思路。然而，为能更系统地辨别不同产区胡芦巴的质量差异，还需对其差异性成分峰进行进一步的指认和含量测定研究。