田爱梅 于 晖

(1西安文理学院生物与环境工程学院，陕西 西安 710065；2浙江大学蔬菜研究所，浙江 杭州 310058)

芥蓝(Brassica alboglabraL.H.Bailey)十字花科芸薹属一年生草本植物，其味道鲜美，含有丰富的维生素A、维生素C、维生素E 及矿物质、类胡萝卜素和酚类化合物、纤维素、糖类等，是一种营养价值很高的功能型蔬菜。此外，芥蓝还含有丰富的硫苷，硫苷在植物防御反应、特殊风味形成和抗癌等方面具有特殊作用，因而，芥蓝是蔬菜中公认的抗癌能手之一[1-4]。

纤维素是植物细胞壁初生壁和次生壁的主要组成成分，由细胞膜外侧的“纤维素合成酶”合成。“纤维素合成酶”包括纤维素合成酶(cellulose synthase，CesA)家族和和类纤维素合酶(cellulose synthase-like protein，CSL)家族[2]。其中，类纤维素合酶包含有典型的β-糖基转移酶，它们可能催化多聚糖(半纤维素的骨架)的合成。类纤维素合酶被划分为9个亚家族(CslA～CslH和CslJ)，其中CSLD与纤维素合酶基因具有高度的序列相似性，表明该亚家族基因在植物生长发育过程中参与了纤维素或半纤维素的合成[5-6]。目前，研究者已在水稻[7]、拟南芥[8]、杨树[9]中证实几个类纤维素合酶也直接参与纤维素的生物合成。前人研究结果发现，不同纤维素合酶可能参与不同细胞壁层纤维素的合成[10-12]，但纤维素合酶确切的生物学功能尚不明确[13-15]。目前已在多种植物中克隆到类纤维素合成酶基因，在拟南芥中发现6个CSLD，玉米中发现5个，水稻中发现5个[16-18]，但在芥蓝中鲜见相关报道。因此，本研究以芥蓝为材料，在克隆类纤维素合成酶基因的基础上，进行序列分析和表达研究，以期为该基因功能的验证奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

芥蓝(白花芥蓝)，种子由西北农林科技大学张恩慧老师惠赠。芥蓝栽植于西安文理学院温室大棚，定植75～85 d 后于花期分别采集叶、花茎、各级花蕾[一级(dm＜2.2 mm)；二级(2.2 mm＜dm＜3.4 mm)；三级(dm＞3.4 mm)]、开放的花和嫩角果，用锡箔纸包好并标记，迅速放入液氮中，于-80℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA合成 植物总RNA的分离根据TIANGEN 公司(北京)RNA 提取试剂盒的方法进行。cDNA 第一链的合成按照cDNA Synthesis Kit Manual(TIANGEN，北京)进行。

1.2.2 芥蓝BaCSLD的克隆 采用DNAMAN 6.0 软件对同源基因序列进行比对分析，设计特异性引物。上游引物P1:5′-ATGGAGAGGAGGTTATCCGTG-3′，下游引物P2:5′-TCACACCGAGAATCCTCCACCG-3′。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以芥蓝cDNA为模板，用Taq 聚合酶进行扩增。PCR 反应体系(20 μL):cDNA 模板(20 mg·L-1) 1 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、2×Taq PCR Master mix 12 μL，ddH2O 补足至20 μL。反应程序:95℃预变性4 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环32次；72℃延伸10 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶检测，切胶、回收后连接于T 载体，转化到大肠杆菌感受态DH5a 中，经蓝白斑筛选、PCR检测后将阳性克隆交由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.3 生物信息学分析及系统进化树的构建为了解BaCSLD在进化过程中的分化情况，选取常见农作物及模式植物(表1)为代表[17]，通过DNAMAN 8和在线工具http:/ /web.expasy.org 推导BaCSLD编码的蛋白序列及特征；根据已经分离的BaCSLD核苷酸序列，用Clustal X 2.1 软件比对CSLD 及其同源序列(表1)；采用Mega 6.0 软件构建进化树，建树方法为最大简约法(maximum parsimony，MP)。

表1 系统进化树中各基因名称对应的物种及序列号Table1 The species and genbank accession numbers corresponding to each gene name in phylogenetic tree

1.2.4BaCSLD的亚细胞定位 以pT::BaCSLD 阳性质粒DNA为模板，借助亚细胞定位引物5′-CGGGAT CCATGCAGAGAGAGCACCGAC-3′和5′-TCCCCCGGG CTAAAAGAGATCAAGAATTTCTGAA-3′，使用南京诺唯赞生物科技有限公司的高保真酶Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 进行扩增。经SmaⅠ和BamHI 限制性内切酶双酶切并胶回收纯化后的BaCSLDCDS片段，利用T4 DNA 连接酶，构建到亚细胞定位载体PGFC-eGFP 上，然后转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，并进行菌液PCR、酶切和测序验证。将转入PGFC-eGFP::BaCSLD 质粒的农杆菌GV3101 活化，挑取单菌斑加入含50 mg·L-1Kan、50 mg·L-1Str和50 mg·L-1Rif的3种抗生素的LB 液体培养基培养过夜。取1 mL 培养液至含20 mL 50 mg·L-1Kan、50 mg·L-1Str和50 mg·L-1Rif的3种抗生素的LB 液体培养基过夜培养。收集菌体后用LB 空白培养基将菌液浓度重悬至0.8(OD600)，将筛选好的阳性质粒PGFC-eGFP::BaCSLD和空载质粒35S::GFP 分别转化根癌农杆菌菌株GV3101，选取生长2～4 周的本生烟植株，选择叶片长度为2个指节的平整的叶片注射。将侵染液室温下放置2～3 h 后注射烟草叶片(避开烟草叶脉)。暗培养1～2 d 后，于FV3000型激光共聚焦显微镜(日本奥林巴斯株式会社)下观察亚细胞定位情况。

1.2.5BaCSLD的时空表达分析 总RNA 提取与cDNA 第一链合成同1.2.1。采用UBQ10 作为参照，根据测序结果设计RT-PCR 引物，上游P1:5′-GCATTA GATGGGTTACAAGG-3′，下游P2:5′-TACCAGCAAGAA ATGACAGC-3′。PCR 反应体系:Taq 聚合酶mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 补足至25 μL。PCR 反应程序:95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s；72℃延伸1 min，共32个循环；72℃延伸8 min，4℃保存。用0.8%琼脂糖凝胶电泳对PCR 产物进行检测。

2 结果与分析

2.1 BaCSLD 序列特征分析

根据同源序列设计引物，扩增了BaCSLDcDNA 序列2 817 bp(图1)。通过DNAStar 软件分析发现该基因序列无内含子，包含一个2 796 bp的完整开放阅读框，编码931个氨基酸，该基因编码的氨基酸序列分子量为104.98 kDa，含有103个酸性氨基酸(D、E)，101个碱性氨基酸(K、R)，354个疏水氨基酸(A、Ⅰ、L、F、W、Ⅴ)，以 及202个 极 性 氨 基 酸(N、C、Q、S、T、Y)。经NCBI 数据库BLAST 同源性比对，发现BaCSLD1 (Brassica oleraceavar.oleraceacellulose synthase-like protein D1)序列与甘蓝类纤维素合成酶(Accession:XM ＿ 013781242) 具有99%的相似性。推测BaCSLD1是类纤维素合成酶家族的成员之一。

图1 CDS 基因全长DNA的扩增Fig.1 Amplication products of BaCSLD gene full-length cDNA

2.2 BaCSLD 编码蛋白的特征

经在线数据库http:/ /www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 分析，BaCSLD属于跨膜蛋白，具有8个跨膜区(图2)。蛋白质专家分析系统(http:/ /ca.expasy.org)分析表明，它们都具有多个活性位点，包括酪氨酸激酶磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-糖基化位点、依赖的蛋白激酶磷酸化位点、酰胺化位点、酰基化位点、蛋白激酶C 磷酸化位点；在线数据库http:/ /smart.Embl-heidelberg.de/smart/job＿status 分析发现，BaCSLD 蛋白具有celluse-synt 结构域。

图2 BaCSLD 跨膜区预测Fig.2 Prediction of transmembrane region of BaCSLD

2.3 BaCSLD 同源序列的系统进化关系分析

利用系统发育软件MEGA5.0 对13种植物材料的CSLD 同源序列进行比对分析，构建MP 系统进化树。由图3可知，BaCSLD 同源序列与拟南芥AtCSLD亲缘关系较近，其次为苦瓜中的McCSLD，而与同属的油菜中的BnCSLD和芜菁中的BrCSLD 关系较远。

2.4 BaCSLD 亚细胞定位分析

为了确定BaCSLD编码蛋白在细胞内的具体存在部位，进行了亚细胞定位分析。将测序正确的PGFCeGFP::BaCSLD载体通过农杆菌介导烟草体内瞬时表达法导入烟草表皮细胞，在共聚焦显微镜下观察GFP 荧光信号。结果显示，BaCSLD与GFP 形成的融合表达蛋白的荧光信号分布在烟草表皮细胞的细胞膜中(图4)。

2.5 BaCSLD的表达分析

RT-PCR检测发现，BaCSLD在芥蓝的三级花蕾及开放的花中表达，而在其他组织中未表达(图5)。因而推测BaCSLD可能在花或者花粉发育过程的后期具有重要的功能。

3 讨论

类纤维素合酶(CSL) 与大量的纤维素合酶(CesA)构成了一个庞大的超基因家族，它们具有很高的序列相似性，且编码的蛋白质都具有糖基转移酶的活性[13，18]。植物体中存在数量众多的纤维素合酶基因，它们可能是漫长的进化过程中染色体发生复制的结果。目前该家族内各个基因的表达模式、功能鉴定和相互作用机制尚不明确[19-20]。

图3 植物CSLD的系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis based on CSLD protein

在植物中纤维素合酶基因主要受转录水平的调控，虽然CesA 蛋白在植物所有的组织和不同类型的细胞中都有表达，但家族中不同成员在植物发育的不同时期、不同的植物组织中的表达存在差异[20-21]。在拟南芥中，AtCesA1 在根、花、莲座叶各个组织中都表达，而AtCesA9 仅在胚的发育过程中以及茎、叶片的连接处有表达[21]。CesA1、CesA9 基因在玉米中不同部位的表达水平也不同[22]。Suzuki 等[23]对毛果杨CSL的表达分析发现，CSL在毛白杨中也具有组织特异性表达。本研究中，BaCSLD仅在芥蓝的大花蕾和开放的花中表达，可见不同的CSLD基因具有不同的表达模

图4 BaCSLD 蛋白在烟草表皮细胞中的亚细胞定位Fig.4 Subcellular localization of BaCSLD in leaf epidermal cells of tobacco

式[23-25]。类纤维素合酶家族中存在多个保守结构域，这些保守域的蛋白质序列赋予了该酶特定功能[26-27]。本研究结果显示，BaCSLD 蛋白具有多个活性位点，多个磷酸化位点的存在可能与BaCSLD的酶活性动态变化相关[28]。目前，有关CSL基因家族功能的研究鲜见报道，大多数的类纤维素合成酶基因功能需要进行全面系统的分析[27-28]。本研究系统进化分析结果表明，BaCSLD 同源序列与拟南芥AtCSLD 亲缘关系较近，这是由于芥蓝和拟南芥同属于十字花科，而BaCSLD 与油菜中的BnCSLD和芜菁中的BrCSLD 关系较远，可能是由于在进化过程中基因序列在一些重要位点发生了分化[29]，因而对该基因的表达模式及其功能分析进行研究尤为重要。

近年来研究者陆续发现了几个植物花粉发育相关的CSL突变体[24，30]。如编码OsCSLD4 蛋白的水稻SLE1(slender leaf1)基因，其突变体SLE1 在花粉形成、花药开裂、气孔形成等发育过程中表现出严重的发育缺陷[24]。类纤维素合酶D亚家族的成员CSLD1和CSLD4 在拟南芥成熟的花粉粒和花粉管中高表达，其突变体植株花粉管细胞壁的纤维素沉积显著降低，而且花粉管细胞壁层序的组织性被明显打破，进一步对花粉管的萌发和生长以及雄配子体的传递效率产生了影响[30]。本研究从芥蓝中分离到的BaCSLD在大花蕾及开放的花中特异表达，推测BaCSLD 可能与芥蓝的生殖发育密切相关，下一步将通过在芥蓝中进行过表达分析结合拟南芥缺失突变体的互补验证对其功能进行深入剖析，为全面了解类纤维素合成酶在植物生殖发育过程中的转录调控模式提供参考。

图5 BaCSLD 基因在芥蓝不同组织中的表达Fig.5 Analysis of the expression pattern of the BaCSLD in different tissues of Brassica alboglabra

4 结论

本研究在芥蓝中分离到类纤维素合成酶基因BaCSLD，分析表明BaCSLD属于跨膜蛋白；亚细胞定位显示，芥蓝BaCSLD 蛋白分布于细胞膜。此外，通过RT-PCR表达分析发现，该BaCSLD仅在芥蓝三级花蕾和开放的花组织中表达，说明该基因可能在花粉发育或植物生殖发育中发挥重要作用。本研究结果为BaCSLD在植物生殖发育过程中的功能及调控作用研究奠定了基础，但其在芥蓝的生殖发育中起到何种调控作用还需进一步深入研究。