徐晶晶 苑 平 柏浩东 廖海民 李祖任

(1贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2湖南省农业科学院，杂草生物学及安全防控生物学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410125)

小飞蓬[Conyza canadensis(L.) Cronq.]是一种常见的旱地恶性杂草，其对经济作物、果园和茶园危害严重[1]。同时，小飞蓬对化学除草剂草甘膦和百草枯产生了严重的抗药性，抗性小飞蓬的治理迫切需要开发安全(包括生物安全和生态安全)的新型除草剂[2]。植物源除草剂正是杂草控制和新型生物源除草剂的研究方向。目前，我国已经形成了一批具有自主知识产权的生物除草剂技术成果，但尚未研制出成分完全为生物来源的除草剂种类，主要原因是生物除草剂本身的生态适应相对较差[3-4]。因此，发掘利用生物除草剂关键资源显得尤为重要，对致力于突破生物除草剂产品开发的成本、环境等限制的功能性研究也不可或缺[5-6]。

前期研究表明，羊脂酸对小飞蓬、稗草等旱地杂草具有良好的抑制效果[7]。进一步推测羊脂酸抑制小飞蓬的机理可能是通过破坏类囊体膜中捕光蛋白复合体(light-harvesting complex，LHC)的功能，从而破坏小飞蓬叶绿体结构，引起叶绿素含量变化，影响其光合作用而杀灭小飞蓬[8-9]。

LHC是一种色素-蛋白复合物，可捕获光能并迅速将能量传递到反应中心，引起光化学反应。光系统Ⅰ和光系统Ⅱ都有各自的LHC[10]。在正常光强条件下，LHCⅡ高效地吸收光能，并迅速将其传递至光合反应中心以引起光化学反应；在胁迫光强条件下(包括过强或过弱光照条件)，LHCⅡ通过结构与功能的调整，可有效调节类囊体膜的能量平衡，尤其是在强光下能以非光化学淬灭方式耗散过剩激发能，进而保护光合器官免遭伤害，从而使光合作用高效进行[11]。瞿玉山等[12]克隆了甘蔗Lhc-a3 基因，定位于叶绿体，无信号肽，有3个不同的跨膜区，是亲水性分泌膜蛋白。陈卫民等[13]研究发现盐生杜氏藻捕光蛋白基因Lhcb家族成员在强光照下的表达整体受到抑制(lhc-b1、lhcb2.1、lhc-b2.2 在强光照处理3 h时表达积累量最低)。但这些研究主要集中于LHC基因的表达差异以及LHC 蛋白的结构和起源进化等，而对于LHC 蛋白与除草剂胁迫相关的功能解析鲜有涉及。

结合前期研究，本研究以羊脂酸处理后的小飞蓬叶片为试验对象，围绕响应羊脂酸处理的捕光蛋白Lhc-Z6基因，依次开展以下工作:采用cDNA 末端快速扩增技术克隆Lhc-Z6基因，对该基因的功能结构域等信息进行预测分析；基于最大似然法构建该基因的系统发育树，并阐明系统进化关系；采用RT-qPCR 方法研究羊脂酸处理后不同时间内小飞蓬叶片中Lhc-Z6基因mRNA 转录水平的差异，以期为揭示光捕获蛋白在小飞蓬响应羊脂酸过程中的调节机制奠定基础，同时为植物源羊脂酸产品研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与主要试剂

小飞蓬种子收集于湖南省农业科学院实验大楼旁荒地，将种子用赤霉素催芽，分别放置于内径为20 cm的小盆子内，于光照16h、光照强度100～120 μmol·m-2·s-1、温度18～20℃条件下培养，待幼苗长至三叶期时备用。97%羊脂酸(自制)，采用蒸馏萃取法提取于椰子油中。

PrimeScript 1st Strand eDNA Synthesis Kit 反转录试剂盒、CLONETECH SMARTer RACE5′/3′Kit RACE试剂盒，大连TaKaRa 公司；SYBR Green Real-time PCR Master MIX，东洋纺(上海)生物科技有限公司。其余试剂均为国产色谱纯或分析纯。

1.2 主要仪器与设备

LightCycler 96 实时PCR 仪，瑞士Hoffman·Roche公司；凝胶成像系统Kodak Gel Logic 200，美国EASTMAN KODAK 公司；Brocade DHP-9020恒温培养箱，山东博科科学仪器有限公司；WWWP-2000 行走式喷雾塔，农业农村部南京机械化研究所。

1.3 试验方法

1.3.1 总RNA的提取和cDNA 第一链的合成 取1 000 μL 羊脂酸，加入30 mL 蒸馏水，用喷雾塔均匀喷雾于小飞蓬叶片，分别于羊脂酸处理0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 h时收集适量小飞蓬叶片，用蒸馏水洗涤，并用吸水纸快速干燥，置于液氮中。经液氮研磨后，通过Trizol 法提取总RNA，通过2% RNA 琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度和完整性，参照反转录试剂盒合成cDNA 第一链[14]。

1.3.2 cDNA 序列片段的获取 采用同源克隆策略，根据已报道的LHC基因cDNA 序列，选择保守性高的位点设计简并引物CocZ6-1和CocZ6-2(表1)。以cDNA为模板，PCR 扩增目的基因片段。25 μL PCR反应体系:cDNA 模板1 μL，上、下游引物各1 μL，Mix 12.5 μL，去离子水9.5 μL。PCR 反应程序:94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次；72℃延伸7 min。通过琼脂糖凝胶电泳检测回收后，将其连接到pMD18-T 载体中并转化到DH5α 感受态细胞中。挑选阳性克隆送至上海生物科技有限公司进行测序，并将得到的序列与GenBank 中获得的序列进行BLAST 同源性分析[15]。

1.3.3 RACE扩增 根据已获得的部分cDNA片段，分别设计5′和3′RACE特异引物(表1)，按照CLONETECH SMARTer RACE5′/3′Kit 扩增试剂盒说明进行扩增，并直接对扩增产物进行测序。将PCR 产物构建成T 克隆并测序，电泳检测和克隆测序步骤与

1.3.2 相同。

1.3.4 序列生物信息学分析 使用NCBI的BLAST进行序列同源性比对和相似性搜索。用ExPaSy website (http:/ /us.expasy.Org/tools/pitoo1.htm)预测计算该基因的分子量和等电点(molecular weight/isoelectric point)MW/pI；在GenBank 中找到涉及LHC的相关蛋白氨基酸序列，选取17个典型的植物蛋白；运用软件ClustalX和Mega 4.1 以邻接法(neighborjoining，NJ) 构建进化树；1 000次自举(Bootstrap) 分析计算各节点支持率[16]。

1.3.5CcLhc-z6基因mRNA 响应羊脂酸的时间表达分析 使用靶基因特异性引物qR-Z6和内部参照基因ACTIN 扩增引物(表1)，按照SYBR Green PCR Mix 试剂盒说明书进行操作。反应体系20 μL:SYBR Premix ExTaqTM 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。反应程序:95℃变性30 s，58℃退火20 s，循环40次。使用2-△△CT法比较靶基因的表达。在Prism 4.0 软件中使用双尾T 检验法对统计数据进行差异显著性分析，以P＜0.05表示具有差异显著性[17]。

2 结果与分析

2.1 CcLhca-Z6基因序列的获得

以提取的小飞蓬叶片总RNA 逆转录获得的cDNA 作为模板进行PCR 克隆。先使引物CocZ6-1简并化并用CocZ6-2 进行PCR 得到了1条约为450 bp的片段(图1-a)，再通过再循环、连接、转化和测序获得核心CcLhca-Z6基因序列。扩增cDNA 5′端序列，使用引物CocZ6-R1 进行第一轮PCR，扩增产物用CocZ6-R2和CocZ6-R3 引物进行第二轮PCR，得到1条约为400 bp的片段(图1-b)。通过回收、连接、转化和测序，获得cDNA 5′末端序列。扩增cDNA的3′末端序列，并使用CocZ6-F1 引物进行第一轮PCR，再用CocZ6-F2 引物对扩增产物进行第二轮PCR，得到1条约为600 bp的片段(图1-c)。将获得的5′ RACE 序列、核心序列以及3′ RACE 序列剪接，从而获得CcLhca-Z6基因cDNA 序列全长(图2)。

表1 小飞蓬捕光蛋白Lhca-Z6基因克隆及RT-qPCR表达引物Table1 The primers used for cloning Lhca-Z6 of Conyza canadensis and RT-qPCR

图1 CcLhca-Z6基因的扩增结果Fig.1 Amplification results of the CcLhca-Z6 gene

2.2 CcLhca-Z6基因生物信息学分析

通过RACE 获得CcLhca-Z6基因(命名为CcLhca-Z6)的全长cDNA 序列，基因阅读框长1 016 bp，编码266个氨基酸(图2)。ProParam 预测编码蛋白分子质量为28.14 kDa，理论等电点为5.29，是一种酸性蛋白质。该蛋白中丙氨酸数量最多，有34个，占总数的12.8%；其次是甘氨酸和亮氨酸，数量分别为33和25个，各占总数的12.4%和9.4%。BLASTP 对LHCI-Z6蛋白保守区的预测表明，该蛋白属于Chloroa＿b-bind家族，包含典型的捕光叶绿素a/b 结合蛋白功能(图3)。系统进化分析表明，不同物种来源的Lhca 蛋白在进化上分属不同分支，其中CcLhca-Z6 蛋白与黄花蒿(PWA84283.1) 蛋白进化程度最为接近，与莴苣(XP023739911.1)进化接近程度次之，均处于同一分支；CcLhca-Z6 蛋白与大蓟(XP024987521.1)、向日葵(XP022012027.1)关系较近，与番茄(NP001316912.1)、马铃薯(XP006356077.1)关系较远(图4)。

图3 CcLhca-Z6 蛋白质保守结构域预测Fig.3 Functional domains predicted for CcLhca-Z6

图4 CcLhca-Z6 与近缘种群的进化分析Fig.4 Phylogenetic tree of CcLhca-Z6 with homologous proteins from other species

2.3 羊脂酸处理对小飞蓬CcLhca-Z6基因表达的影响

由图5可知，随着羊脂酸处理时间的延长，小飞蓬叶片中CcLhca-Z6基因的相对表达量呈先升高后降低的趋势，在处理时间为2 h时，CcLhca-Z6基因的相对表达量达到最大值，为对照(处理0 h)的20.63倍，此结果与前期蛋白质组学结果相似[8]。这可能是由于羊脂酸胁迫能诱导小飞蓬Lhca-Z6基因表达，但胁迫时间较长(大于2 h)后小飞蓬机体受到损伤，不能再大量表达Lhca-Z6基因，因此该基因的mRNA 水平在2 h 后呈现逐步降低的趋势。

图5 羊脂酸处理对CcLhca-Z6基因相对表达的影响Fig.5 Effect of caprylic acid treatment on relative expression of CcLhca-Z6

3 讨论

研究表明，大戟科的蓖麻、麻风树、木薯和橡胶树分别含有6、6、9和9个Lhca基因，分属于Lhca1、Lhca2、Lhca3、Lhca4、Lhca5和Lhca6 等6个亚家族，每个亚家族含有1～2个成员，基因内含子数量在2～5之间[18]。而李利超等[19]采用生物信息学的方法研究发现，毛竹共有29个LHC基因同源序列，Wei 等[20]采用单粒子冷冻电子显微镜技术解析了LHCII的结构，其为同型二聚体超分子系统，每个单体均含有25个蛋白亚族、105个叶绿素、28个类胡萝卜素和其他辅助因子。同时 Berg 等[21]首次报道了布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)的LHCs，它是由单体和三聚体形成的多聚复合物。综上，在多种植物中Lhca基因的分类和结构已得到较为深入的研究，在拟南芥中也有关于Lhca基因的研究报道[22]，但相对而言，有关菊科植物的Lhca基因的研究还较少且不够系统。本研究从菊科植物小飞蓬叶片中克隆了一个Chloroa＿b-bind家族成员CcLhca-Z6的cDNA 序列，系统进化分析表明，小飞蓬与黄花蒿(PWA84283.1)蛋白进化程度最为接近。

作为光合作用过程中最重要的复合物之一，PSⅠ和PSⅡ在电子转移、抵抗逆境及状态转换等方面起着重要作用。而作为PSⅠ中重要的组成部分，LHCⅠ蛋白通过与叶绿素的结合在光合作用中极其关键[23]。LHC基因编码的蛋白分别属于光系统Ⅰ和光系统Ⅱ的捕光色素结合蛋白家族LHCⅠ和LHCⅡ；29个蛋白均包含导肽和成熟蛋白，具有跨膜结构域，均包含色素结合位点；且大多数LHC基因主要在叶片和花序中表达[19]。宁璞等[24]通过基因组步移技术克隆雌性和雄性配子体中的5′-侧翼序列，并明确了其具有启动子功能。高等植物中Lhca和Lhcb基因的表达主要受转录水平的调控，启动子是该调控的一个重要组成部分[25]。本研究也得到了一致的结论，即小飞蓬CcLhca-Z6基因表达的调控能在转录水平进行，但其具体的调控机制仍有待后续研究。同时，今后仍需明确小飞蓬叶片中CcLhcz-Z6的表达量是否受捕光蛋白基因启动子多样性的影响。

Gonzalez 等[26]从转录和蛋白产物的角度探明了耐除草剂基因aad-1的7个调控原件特性，为下一步在玉米育种中设计单基因或多基因构图上提供了有效信息。因此，发掘利用响应羊脂酸抑制小飞蓬的关键基因CcLhca-Z6，明确其编码框全长序列、基因结构、启动子功能等关键信息，可为后续基因功能验证提供基础。

据报道，在LHC基因家族中，Lhca和Lhcb基因的表达受多种应激(如氧胁迫、盐胁迫)的调节[27-28]。LHC 复合体的多基因在光、温度、水、营养等环境的变化过程中，必然会通过改变其编码组成的亚基结构来发挥适应环境变化的重要作用。在光调节过程中，整体高光抑制Lhcb基因的表达，而黑暗条件诱导表达，每个基因的表达都有细微的差异，这可能是植物适应环境的一种方式[29-30]。Bjorkman 等[30]研究表明，水分胁迫使光合作用系统倾向于发生光抑制，同时植物经水分胁迫时，任何降低激发能量或以非破坏方式耗散能量的机制都会降低对光合作用系统的损害程度。Deng 等[31]通过半定量PCR和Northern 杂交分析发现，LeLhc-b2 基因的表达受4℃和NaCl 诱导。在低温条件下LeLhc-b2 基因通过渗透胁迫和氧化胁迫应激来抑制其过表达。Kong 等[32]采用RT-qPCR和Northern杂交分析表明，LeCD-J1 基因在叶绿素含量高的叶片中表达量高，同时该基因的表达受温度(4、38、42、45℃)、NaCl、PEG、MV和H2O2的诱导，其表达水平随着应激处理时间的延长而变化。本研究结果显示，羊脂酸处理小飞蓬叶片0～8 h 后，CcLhca-Z6基因的表达存在显著差异，推测CcLhca-Z6基因可能是小飞蓬响应羊脂酸胁迫的关键基因。

4 结论

本研究克隆了小飞蓬的CcLhca-Z6基因，其序列全长1 016 bp，编码266个氨基酸，分子量为28.14 kDa，理论等电点为5.29。系统进化分析表明，小飞蓬与黄花蒿(PWA84283.1)蛋白进化程度最为接近。羊脂酸处理显著影响小飞蓬叶片CcLhca-Z6基因表达，并随着处理时间的延长呈现先升高后降低的趋势。本研究结果为揭示捕光蛋白在小飞蓬响应羊脂酸过程中的调节机制奠定了基础，也为植物源羊脂酸产品研发提供了依据。而在小飞蓬叶片内Lhca的表达量是否受捕光蛋白基因启动子多样性的影响及其影响机制，以及羊脂酸胁迫下小飞蓬差异表达的其他相关基因及功能仍有待进一步深入研究。