增强UV-B辐射对光氧化水稻812HS光合特性和生长的影响

2020-04-10王林叶吉冰璇曾彦达张启军张美萍吕川根

核农学报 2020年5期

王林叶吉冰璇曾彦达张启军张美萍吕川根

(1山西师范大学生命科学学院，山西临汾 041004；2江苏省农业科学院粮食作物研究所，江苏南京 210014)

人类大量使用氯氟烃等物质使大气的臭氧层逐渐变薄，到达地面的UV-B(280～320 nm)辐射增强，对人类活动、动植物和微生物生长造成了严重影响[1-4]。增强UV-B辐射会造成植物的DNA 损伤[5-7]、生理生化过程发生紊乱[8-12]、生长受阻并最终降低产量[13-16]。光氧化现象在水稻中普遍存在，早稻苗期长期处于低温阴雨天气之后突然转晴，或者生育后期长期阴雨天气后突然转晴，亦或晚稻生育后期遭遇冷空气侵袭后转晴，这类天气都极易引发水稻光氧化现象[17]。水稻发生光氧化会导致叶片失绿(黄化)甚至死亡，从而影响稻谷产量[18]。水稻光氧化突变体812HS 来源于一个普通水稻不育系812S(野生型)，两者农艺性状基本相同，在幼苗期两者的叶色表型基本无差异，但在低温寡照的江南梅雨季节过后、田间自然光照明显增强的情况下，812HS的叶片表现出明显的失绿现象，其野生型812S的表型并无明显变化，而在光强中等或较弱时，812HS的整体叶色又可恢复为正常绿色[19]。研究表明，812HS是研究水稻叶片光氧化特性的好材料，其光氧化特性由一个新基因LPO控制[20]。812HS的光氧化现象由强光引起，增强UV-B辐射是否会加剧对812HS或其他光氧化水稻叶色表型的影响，影响程度是否强于普通水稻等，目前鲜见相关报道。因此，本试验以812HS为材料，以其野生型812S 代表普通水稻，研究UV-B 增强辐射对812HS的光合生理及生长的影响，旨在为水稻光氧化现象研究提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及其培养

以水稻光氧化株系812HS(突变体)为试验材料，以其野生型812S 代表普通水稻(对照)。于2018年5-8月在江苏省农业科学院粮食作物研究所(32°03′N、118°47′E)进行盆栽试验。盆钵直径20 cm，高25 cm。水稻种子经浸种、催芽后直播于盆钵，每个处理重复6次(盆)。三叶期留取生长状况基本一致的幼苗，每盆3 穴，每穴1 苗，采用常规水肥管理。

1.2 辐射处理

设置2个处理组，即增强UV-B辐射处理和自然光对照。增强UV-B辐射下生长的812HS 记为L1，812S 记为L2。自然光条件下生长的相应对照812HS记为CK1，812S 记为CK2。在室外自然条件下，将UV-B 灯管等距离水平悬挂于水稻植株上方，通过调节UV-B 灯架与植株顶端间的距离来控制辐射剂量，采用40 kJ·m-2·d-1剂量[相当于增强本地自然光中UV-B辐射量的40%左右，用XP-4000 紫外强度计(上海遂欧仪器有限公司)核定]的UV-B辐射处理，每天白天处理9 h(阴雨天除外)，共计处理65 d。

1.3 水稻各项指标的测定方法

1.3.1 叶绿素含量的测定分别于幼苗期、分蘖期、拔节期、抽穗期、灌浆期使用SPAD-502Plus SPAD 仪(常州德图精密仪器有限公司)测定距叶尖三分之一处的叶绿素含量。每个处理测定10 张叶片，取平均值。

1.3.2 灌浆期叶绿素合成代谢中间产物

1.3.2.1 5-基乙酰丙酸含量的测定参照王凌健等[21]的方法并略加改动。准确称取0.5 g 叶片并用液氮研磨，按照1∶5的体积比加入4%三氯乙酸充分研磨成浆并定容至20 mL，8 000×g离心5 min；取1 mL 上清液加入0.5 mL 1 mol·L-1醋酸钠和50 μL 乙酰丙酮，充分摇匀后100℃水浴10 min，放置室温冷却后于8 000×g离心5 min，取1.5 mL 上清液加入1.5 mL Ehrlich-Hg 显色剂(取2 g 对-二甲氨基苯甲醛加入60 mL 冰醋酸，再加入16 mL 高氯酸，用冰醋酸定容至100 mL，最后加入0.3 g 氯化汞)，暗处理15 min 后用GS54 紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)测定553 nm 波长处的OD值。5-基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)含量以553 nm的消光系数7.2×104L·mol-1·cm-1计算。

1.3.2.2 胆色素原含量的测定参照Bogorad[22]的方法。称取0.5 g 叶片，用液氮充分研磨，加入5 mL缓冲液(0.1 mol·L-1EDTA、0.6 mol·L-1Tris，pH值8.2)，于12 000×g条件下离心10 min。取上清液2 mL，加入2 mL Ehrlich-Hg 显色剂，暗处理15 min 后用紫外可见分光光度计测定553 nm 波长处的OD值。胆色素原(porphobilinogen，PBG)含量以553 nm的消光系数6.1×104L·mol-1·cm-1计算。

1.3.2.3 尿卟啉原Ⅲ含量的测定参照Bogorad[22]的方法。称取1 g 叶片，加入液氮研磨后再加入10 mL 0.067 mol·L-1PBS 缓冲液(pH值6.8)研磨成浆，12 000×g离心10 min。吸取5 mL 上清液，加入0.25 mL 1%Na2S2O3，漩涡震荡并用强光照射20 min，然后用1 1 mol·L-1冰醋酸调节pH值至3.5，用8 mL 乙醚反复萃取3次，测定水相在405.5 nm 波长处的OD值；乙醚萃取液合并后用3 mL 0.1 mol·L-1盐酸萃取，测定盐酸相在395.5 nm 处的OD值。尿卟啉原Ⅲ(urogenⅢ)含量以消光系数5.48×105L·mol-1·cm-1计算。

1.3.2.4 原卟啉Ⅸ、镁原卟啉Ⅸ和原脱植基叶绿素含量的测定参照Hodgins 等[23]的方法。准确称取0.3 g 叶片，加入25 mL 80%碱性丙酮，充分研磨后于4℃条件下15 000×g离心15 min，吸取上清液后分别在575、590和628 nm 波长处测定OD值。原卟啉Ⅸ(ProtoⅨ)、镁原卟啉Ⅸ(Mg-ProtoⅨ)和原脱植基叶绿素(Pchlide)含量计算公式如下:

1.3.3 叶绿素a 荧光诱导动力学参数的测定按照Strasser 等[24]的方法，使用HandyPEA 连续激发式荧光仪(Hansatech，英国)测量叶绿素a 荧光诱导动力学参数。用夹子夹住水稻叶片，暗处理20 min 后用光量子为3 000 μmol·m-2·s-1的饱和红闪光照射，仪器自动记录相应数据，采用PEA Plus Hansated 软件计算和分析数据。每个处理测量6 张叶片，取平均值。

1.3.4 分蘖数、有效分蘖数和株高的测定每个处理随机选取12株水稻，计数分蘖数和有效分蘖数，取平均值；测量每个植株基部至穗顶部的高度，以平均值作为株高。

1.3.5 数据分析应用Microsoft Office Excel 2017和SPSS 21.0 对数据进行分析和处理。采用t检验方法、单因素方差分析和Duncan’s 多重比较进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 增强UV-B辐射对水稻叶绿素含量的影响

由图1可知，L1和L2的叶绿素含量变化趋势基本一致，在分蘖期至抽穗期均上升，在抽穗期和灌浆期均下降。与相应的CK1和CK2相比，L1和L2的叶绿素含量在分蘖期均显著减少(P＜0.05)，L1的降幅显著低于L2(少降4.7个百分点，P＜0.05)。生长中后期，812HS的叶绿素含量优势更明显，在抽穗期，相比于L2的无变化(与CK2 比)，L1 则显著提高了15.3%(与CK1 比)(P＜0.05)；在灌浆期，L1 较CK1 显著增加了48.7%(P＜0.05)，比L2的增幅(与CK2 比)多34.4个百分点，差异极显著(P＜0.01)。

图1 增强UV-B辐射对水稻叶绿素含量的影响Fig.1 Effect of enhanced UV-B radiation on the chlorophyll content of rice

2.2 增强UV-B辐射对水稻灌浆期叶绿体合成代谢中间产物的影响

由图2-A、E可知，增强UV-B辐射后，与CK1相比，L1 胆色素原含量降低了29.7%，而原卟啉Ⅸ含量增加了38.2%，导致灌浆期叶绿素含量仍然增加。由图2-B、C、D、F可知，其他指标均无显著变化。上述结果表明，增强UV-B辐射使812HS 在灌浆期的原卟啉Ⅸ的合成量增多，导致叶绿素含量增加，

由图2-B可知，增强UV-B辐射后，在叶绿素生物合成过程中，与CK2相比，L2的原脱植基叶绿素含量增加了55.4%。由图2-A、C、D、E、F可知，其他指标均无显著变化。上述结果表明，原脱植基叶绿素含量的增加会导致L2 叶绿素含量增加。

综上，增强UV-B辐射会影响812HS 在叶绿素的生物合成过程中的胆色素原、原卟啉Ⅸ的合成，以及普通水稻中原脱植基叶绿素的合成。

2.3 增强UV-B辐射对叶绿素a 荧光参数的影响

2.3.1 增强UV-B辐射对PSⅡ光合性能的影响由图3可知，L1 与L2的Fv/Fm值变化趋势基本一致。与自然光生长相比，在拔节期，L1的Fv/Fm值降低3.9%(P＜0.05)，同时，FO增加11.6%，Fm降低9.6%；在灌浆期，L1的Fv/Fm值基本无变化，而L2 增加了4.9%(P=0.03)，同时，L2的FO降低22.4%，Fm降低11%。以上结果说明，增强UV-B辐射后，812HS和812S的PSⅡ原初光能转化效率均降低。812HS的光合反应中心在拔节期遭到破坏，出现光抑制，而812S 则在灌浆期天线色素降解，光合反应中心失活，其PSⅡ原初光能转化效率却升高，这可能与叶绿素含量增加有关。

由图3-A可知，L1 与L2的Fv/Fm值均在幼苗期至拔节期下降，拔节期至抽穗期升高，灌浆期又下降。与自然光生长相比，L1 分蘖期的Fv/Fm值显著增加3.2%(P＜0.05)，较L2的增幅高1.8个百分点，但差异不显著；在拔节期，L1的Fv/Fm值显著降低3.9%，较L2 降幅多1.4个百分点(P＞0.05)；在灌浆期，L1的Fv/Fm值基本无变化，而L2 显著增加了4.9%(P＜0.05)。综上说明，增强UV-B辐射提高了812HS 分蘖期PSⅡ原初光能转化效率，且比812S 提高效率更明显，但降低了其在拔节期和灌浆期的PSⅡ原初光能转化效率。

由图3-B可知，L1 与L2的FO值变化趋势基本一致，幼苗期至拔节期升高，拔节期至抽穗期下降，随后又升高。在拔节期，L1的FO值与CK1相比增加了11.6%，而L2 与CK2相比无明显变化，表明L1的PSⅡ光合结构被破坏或者发生可逆失活，导致原初光化学效率下降。在灌浆期，L1的FO值与CK1 间无明显差异，而L2 较CK2 显著增加了22.4%，说明812HS的天线色素不受影响，而普通水稻的天线色素明显降解。

由图3-C可知，L1和L2的Fm值在幼苗期和分蘖期均上升，随后，L1 表现相对稳定状态，而L2 有继续平稳上升的趋势；在抽穗期，L1的Fm值显著降低9.6%，而L2 无显著差异；在灌浆期，L1 无显著差异，但L2 显著降低11%，表明812HS 在抽穗期出现了光抑制，而812S 则在灌浆期出现光抑制。

2.3.2 增强UV-B辐射对荧光动力学曲线的影响由图4-A、B可知，与自然光生长相比，2个水稻的OJIP曲线在分蘖期和拔节期J-Ⅰ相均降低，表明快还原型库PQ 遭到破坏，电子从QA-向QB-传递过程受阻，光合结构被破坏或者发生可逆失活。由图4-C可知，在抽穗期，2个水稻的OJIP 曲线均无明显变化；在灌浆期，与自然光生长相比，L1的荧光动力学曲线无显著变化，而L2的O、J、Ⅰ、P 点均下降，PSⅡ的电子传递受到抑制(图4-D)。

图2 增强UV-B辐射对水稻叶绿素合成中间代谢产物的影响Fig.2 Effects of enhanced UV-B radiation on intermediate metabolites of chlorophyll synthesis in rice

上述结果表明，增强UV-B辐射后，812HS 在拔节期的叶绿素荧光诱导曲线(OJIP)受到影响，其快还原型库PQ 遭到破坏，电子从QA-向QB-传递过程受阻，而812S 则在拔节期和灌浆期均受影响，光合结构被破坏或者发生可逆失活。

2.4 增强UV-B辐射对水稻生长特性的影响

由图5可知，与自然光生长相比，2个水稻的分蘖数和有效分蘖数均减少，株高均降低。L1的分蘖数、有效分蘖数和株高分别下降10.0%、16.3%、12.9%，其中株高的降幅较L2(14.6%)少2.0个百分点，两者差异显著(P＜0.05)。表明增强UV-B辐射使812HS和812S的生长量均降低，但812HS 受到的伤害较812S 轻，说明增强UV-B辐射812HS 农艺性状的影响弱于812S。

图3 增强UV-B辐射对水稻PSⅡ光合性能的影响Fig.3 Effect of enhanced UV-B radiation on PSⅡphotosynthetic properties of rice

3 讨论

植物的形态、生理特征和生长量的变化可准确反映外界环境的影响，UV-B辐射的影响最终体现在植物的生长上，且因植物品种的不同和辐射剂量的大小而异，不同品种或者同一品种在不同发育时期对UV-B辐射敏感度也有不同[25-26]。增强UV-B 抑制水稻生长，使植株分蘖数、有效分蘖数减少，植株矮化[27-29]。本试验中，增强UV-B辐射65 d 后，812HS和812S的分蘖数和有效分蘖数均减少，植株均矮化，2个品种的分蘖数和有效分蘖数降幅无显著差异，但812HS株高的降幅显著小于812S，表明增强UV-B辐射对光氧化水稻812HS 生长的抑制程度弱于普通水稻。唐莉娜等[30]研究表明，增强UV-B辐射抑制水稻生长，使株高变矮，分蘖数减少，本研究与此结论一致。

光合作用与植物的生长和发育密切相关，光合作用的物质基础是叶绿素，其含量高低直接影响植物对光能的吸收和传递。本研究中，增强UV-B辐射后，812HS的叶绿素含量在分蘖期显著减少，抽穗期后显著增加，尤其是在灌浆期，其增幅较普通水稻高，可能是植株幼嫩叶片(分蘖期)突然遭受UV-B辐射时叶绿素合成受阻，随后，植株逐渐适应了UV-B辐射并启动了某些机制，如叶绿素生物合成中增强UV-B辐射使得812HS 分蘖期的PSⅡ原初光能转化效率(Fv/Fm)提高，在拔节期有所降低，这与普通水稻无差别，但812HS光合特性在灌浆期不受显著影响，而普通水稻的FO和Fm均降低，这可能与光合作用相关的其他一些因子受到影响有关，如内源激素等[31]，此方面尚有待进一步深入研究。812HS 拔节期Fv/Fm值降低。FO值升高，Fm降低，同时J-Ⅰ相降低，说明电子从向的传递过程受阻，快还原型PQ 库遭到破坏，使得PQs和PSI 蛋白复合体失活。这与乔媛等[32]的研究结果一致。而增强UV-B辐射对812S 生长的抑制程度更强，其天线色素含量降低，光合结构被破坏或者发生可逆失活，在灌浆期OJIP 曲线整体下降，发生光损伤、光抑制、光氧化，这种现象在光氧化水稻812HS中并不明显。周党卫等[33]曾报道，增强UV-B辐射会降低叶片的光合色素。但本研究结果表明，增强UV-B辐射并不会明显降低光氧化水稻812HS的天线色素。具体原因尚有待深入研究。