张彭飞 苑克勇 黄正蔚

牙菌斑是指细菌以生物膜的形式附着于口腔软硬组织表面而形成的复杂微生物群落[1]，可导致龋齿、牙龈炎、牙周炎等口腔疾病[2-4]。唾液中的大量微生物及宿主饮食中的营养物质等因素使得菌斑的产生不可避免，因而去除牙菌斑，维护口腔卫生成为预防和治疗口腔常见疾病，保障牙体和牙周组织健康的重要措施。控制菌斑的方法有很多，如机械法，药物法，免疫疗法等。其中，机械法去除牙菌斑是最常见且可靠的，如刷牙、使用牙线、牙签、牙间隙刷等，因其方便快捷在日常生活中逐渐得以普及[5-7]。但相较于其他机械去菌方法，人们对刷牙的依从性更好。并且多项研究表明，通过刷牙可有效去除牙齿表面的牙菌斑/生物膜，对预防口腔疾病，特别是龋齿、牙龈炎和牙周炎等有重要作用[2-4]。因此，在个人日常口腔卫生保健中使用牙刷已经成为多数人洁齿护齿的重要方法[5]。

一般认为，使用手动牙刷是保持口腔卫生的基本方法。自20 世纪60 年代初电动牙刷问世以来[8]，对于电动牙刷的研究和开发日趋增多，其作为一种新形式的口腔保健方法也逐渐为大众所认可。电动牙刷通过一定振动频率的刷头的侧向及旋转运动来模拟牙刷的手动运动[9]，因此，不同的刷头类型对电动牙刷功效的影响也不尽相同。磨损是由于牙体硬组织因外力(单纯机械磨擦)造成慢性磨耗的现象，可由遗传因素，如先天性釉质发育不全等，酸蚀，磨牙症，横刷牙等引起[10]。横刷牙对牙齿颈部磨损影响较大，可导致牙本质过敏，楔状缺损等疾患。而牙刷毛的软硬度也是影响刷牙对牙齿磨损的重要因素[11]。

本实验通过构造变异链球菌(S.mutans)和内氏放线菌(A.naeslundii)双菌种生物膜[12-13]，在体外模型中用不同硬软头电动牙刷对牙面菌斑生物膜进行接触式去除，旨在比较硬软头电动牙刷之间菌斑清除的功效；用硬软头电动牙刷对磨片分别处理，借以对比不同硬度刷毛对釉质磨损的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

脑心浸液培养液、琼脂及血平板培养基(BD,美国)；接种针、牛恒磨牙、革兰氏染色剂 (上海生工生物科技)；95%乙醇；1%结晶紫；0.9%生理盐水；牙膏(Colgate®，美国)；上朵SD01电动牙刷(尼龙丝刷头:刷头大小均10 mm×18 mm，刷毛数量1 800 根/支，刷毛直径0.127 mm、纳米软胶刷头：刷头大小均10 mm×18 mm，刷毛数量1 800 根/支，刷毛直径0.127 mm)、上朵YB8702手动牙刷(刷头大小10 mm×18 mm，数量1 600 根/支，刷毛直径0.152 mm)(深圳市优尼雅时尚电器有限公司)。

1.2 实验设备

超净工作台；厌氧培养箱(含体积分数80%的N2、10%的CO2和10%的H2)、分光光度仪、 超速离心机(Beckman Optima L-100XP，美国)；酶标仪(BIO-TEK，美国)；光学显微镜(Whitley DG250,英国)；SEM(FEI,Qnanta-200F，荷兰)。

1.3 实验菌株培养及纯度鉴定

本实验采用的S.mutansUA159和A.naeslundiiT14V-J1由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔微生物重点实验室提供。室温下复苏-80 ℃冰箱中的细菌冻存液后，吸取30 μl菌液，四区划线法涂布于固体培养基上。厌氧培养48 h后, 挑取单克隆菌落于4 ml BHI培养基中继续厌氧培养，变异链球菌(S.mutans)培养24 h，内氏放线菌(A.naeslundii)培养48 h。 革兰氏染色鉴定两菌种纯度。

1.4 生物膜模型建立

将2 种细菌悬液室温下以12 000 r/min离心5 min取沉淀， 并用0.9%生理盐水清洗2 次以消除细菌团块。然后用BHI培养液稀释，在600 nm波长下用分光光度仪测量稀释后菌液A值，将A值为0.5的2 种菌液稀释液作为原液，调整菌液浓度为3×108CFU/ml。 将去除全部软组织的离体牛牙颊面在无菌条件下制备成8 mm×8 mm×2 mm大小釉质磨片， 共12 片， 分为4 组， 每组3 片。 121 ℃高压蒸汽灭菌20 min， 分别置于24 孔板中。将稀释后的S.mutans及A.naeslundii细菌悬液各取100 μl依次滴至磨片表面，并用BHI将每孔补齐至1.5 ml将牛牙釉质磨片完全覆盖。将孔板置于37 ℃培养箱中厌氧培养，24 h换液，共培养48 h，在磨片表面形成双菌种生物膜。

1.5 牙刷处理菌斑生物膜

将已形成生物膜的牛牙釉质磨片分4 组， 每组3 片。 分别为： A:对照组，不做处理； B:硬刷毛电动牙刷组，使用上朵SD01高频振动牙刷及尼龙丝刷头处理； C:软刷毛电动牙刷组，使用上朵SD01高频振动牙刷及纳米软胶刷头处理；D：手动牙刷组，使用上朵YB8702手动牙刷处理。电动牙刷振动频率43 200 次/min，生物膜和牙刷刷毛均浸没于含17%牙膏(Colgate®，美国)的BHI培养液中。后3 组分别用相应的牙刷对磨片表面菌斑生物膜进行接触式处理，牙刷均用砝码加重后，垂直向施加1.5 N力于釉质磨片，自近中至远中磨刷5 s[14-15]。

1.6 结晶紫吸附半定量实验

将牛牙釉质磨片置于24孔板， 1 ml 0.9%生理盐水漂洗生物膜3 次以去净未结合到磨片上的细菌。每孔加入1%结晶紫染液1 ml， 静置15 min后吸弃染料， 0.9%生理盐水漂洗3 次去净未结合的染液。每孔加入500 μl 95%乙醇，摇床脱色30 min。取倍比稀释后的结晶紫脱色液100 μl至96 孔板(每组3 个复孔，实验重复3 次)， 565 nm波长处用酶标仪下测定各孔吸光度(A值)。对照组结晶紫脱色液A值可半定量测量生物膜形成量，各个处理组的结晶紫脱色液A值可作为处理后剩余的生物膜量。各个处理组的生物膜去除量可按以下方法计算：

生物膜去除量=对照组A值-处理组A值

1.7 磨损实验

另制取3片8 mm×8 mm×2 mm牛牙釉质磨片，树脂包埋固定后，分为3 组。 A: 对照组，不做处理； B: 硬刷毛电动牙刷组，使用上朵SD01高频振动牙刷及尼龙丝刷头接触式处理； C: 软刷毛电动牙刷组，使用上朵SD01高频振动牙刷及纳米软胶刷头接触式处理。电动牙刷振动频率43 200 次/min，使用含17%牙膏的0.9%生理盐水作为磨损液。牙刷均用砝码加重后，垂直向施加1.5 N力于釉质磨片，自近中至远中磨刷1 h后， 用0.9%生理盐水清洗2 次以去除釉质磨片表面磨损液。之后将各组标本置于SEM下，观察釉质磨片的表面形貌。

1.8 统计学处理

采用SPSS 20.0进行统计处理。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)比较各处理组间生物膜去除量的差异，以P≤0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 结晶紫吸附实验结果

各处理组菌斑生物膜去除量结果如图1，电动牙刷和手动牙刷均能有效的去除菌斑生物膜。上朵SD01电动牙刷+尼龙丝刷头菌斑生物膜去除量(0.45±0.02)与上朵SD01电动牙刷+纳米软胶刷头(0.44±0.03)均大于YB8702手动牙刷组(0.25±0.02)，差距具有统计学意义(t=6.31，P<0.01；t=5.13，P<0.01)。而两电动牙刷组菌斑生物膜去除量差距无统计学意义(t=0.35，P=0.75)。

图1 结晶紫染色法比较各组菌斑生物膜去除量

2.2 SEM观察结果

SEM下3 组釉质磨片表面形貌如图2。未经刷牙处理的釉质磨片(对照组)表面呈现较平整光滑的表面，无明显凹陷；使用上朵SD01高频振动牙刷及尼龙丝刷头处理的硬刷毛电动牙刷组，釉质磨片表面呈现大量密集不平整的凹陷，凹陷程度较深；使用上朵SD01高频振动牙刷及纳米软胶刷头处理的软刷毛电动牙刷组，釉质磨片表面呈现散在分布凹陷，凹陷数量较B组的少，凹陷程度也较B组稍浅。可以看出，使用电动牙刷刷牙会对釉质表面造成磨损，且牙刷刷毛硬度越大，造成釉质表面的凹陷越大越深越多，表面形态越粗糙，对釉质的磨损越重。

图2 各组釉质磨片表面形貌(SEM， ×5 000)

3 讨 论

牙菌斑是导致龋患和牙周病的重要因素。唾液中的蛋白或糖蛋白吸附到牙面上形成获得性薄膜后，很快不同种类的细菌按照不同的时空顺序黏附到获得性薄膜上从而形成牙菌斑生物膜。最早定植于牙面的细菌是链球菌和放线菌，之后更多致病和共生的菌株逐渐黏附其上，引起龋病，牙周病等疾病[12-18]。因而有效的去除牙菌斑生物膜就成为保护口腔健康的一项重要措施。刷牙则是日常生活中控制菌斑最普遍且有效的方法。随着科技的发展，电动牙刷，磁疗牙刷，负离子牙刷等相继出现，并逐渐走入大众的视野，其中应用广泛的仍然是电动牙刷。

变异链球菌(S.mutans)是目前公认的主要致龋菌之一。其胞壁表面的脂磷壁酸，蛋白多糖等使得细菌在牙表面能够黏附定植[16,18]；并具有产酸耐酸等毒力特征，在16 h内就能在牙面形成致密的菌斑生物膜[12]。内氏放线菌(A.naeslundii)也是牙面菌斑生物膜早期定植的先锋菌之一，且与变异链球菌对营养物质无竞争性抑制[12,17]，因而在早期牙菌斑生物膜的形成发展过程中，两者起着非常重要的作用。Verkaik等[13]对各类体外菌斑生物膜去除实验模型进行比较发现：A.naeslundii和S.mutans作为先锋菌，二者通过共聚集作用定植于获得性薄膜上，黏附力相对于单菌种或的其他多菌种生物膜更强。更适宜用作菌斑去除实验的体外模型。这与Paramonova等[19]的研究结果是一致的。本实验同样采用A.naeslundii和S.mutans双菌种，通过BHI培养液吸附到牛牙釉质磨片上形成生物膜，能够有效模拟体内菌斑生物膜的特性，而且容易定量培养，利于后续重复实验。

刷牙过程中牙刷是必不可少的工具，刷头与牙面的摩擦起着主要清洁作用。清洁效果是评价牙刷功能最主要的方面。本实验通过牛牙釉质磨片及双菌种生物膜构建的体外模型，来比较不同刷头的电动牙刷接触式刷牙时的菌斑清除效率，从而对口腔保健提供依据。本实验结果显示，电动牙刷和手动牙刷均能有效去除牙面菌斑生物膜，这说明通过刷牙能够有效的去除菌斑，对维护口腔清洁和健康具有重要积极作用。且电动牙刷的菌斑清除效率均比手动牙刷高，具有统计学差异，这说明相较于传统的手动牙刷，电动牙刷能够更大程度的去除牙面菌斑生物膜，保障牙体及牙周组织健康，这与多项研究结果一致[3-4,14,18-21]。Schmidt等[22]还通过使用电动牙刷处理邻面菌斑生物膜体外模型，并用共聚焦显微镜观察处理后的生物膜，计算总生物量，研究得出对于手动牙刷难以清洁到邻面菌斑生物膜，电动牙刷表现出了良好的清洁功效，对预防邻面龋等有着更为积极的作用。另外，电动牙刷对于特殊人群[23]，以及调动刷牙积极性上也有着不可替代的作用。因而，电动牙刷具有更优良的口腔保健能力。

本实验采用大小，形状类似，但硬度不同的电动牙刷刷头来比较不同硬度刷毛的电动牙刷对菌斑生物膜去除功效的影响，结果显示2 种刷头电动牙刷处理后菌斑生物膜去除量无统计学差异。这说明，对电动牙刷而言，刷毛的材质并不会影响其对菌斑生物膜的清除功效，这与Schmickler等[24]的研究结果是一致的。

在日常生活中，牙齿磨损是不可避免的[10,25]。如果发生重度磨损，则可能会导致咬合紊乱、咀嚼功能下降，颞下颌关节紊乱病(TMD)等，给人们的生活带来严重的影响。所以，尽量减少牙齿磨损对口腔保健至关重要[10-11,25]。刷牙是广泛使用的口腔保健措施，从摩擦学角度看, 刷牙是牙刷、牙膏和牙齿之间相互摩擦的过程,而这种摩擦会导致牙齿釉质表面基本结构的改变。因刷牙导致的牙齿磨损早已被大量临床和实验研究所证实, 又被称为“刷牙磨损”。刷牙的频率，刷牙的力度，刷牙的时长，刷毛的软硬，牙膏的种类等[26-28]都可能对刷牙时釉质的磨损产生影响。本实验选用与人牙结构成分类似的牛牙，而未选用临床拔取的人离体牙，是因为大众人群难免会接受一些口腔保健措施，且方式、效果不尽相同，用其作为样本一致性较差。使用从未接触过口腔卫生保健的牛牙，可以保证各组样本初始特性具有一致性。由于目前对于刷毛的软硬对釉质的磨损的研究较少，故本实验将研究对象控制为刷毛硬度。广泛宣传的刷牙时间为每次至少2 min[3-5,21-24]，故本次实验设计1 h刷牙时间来模拟1年的刷牙时长。在本次实验中， SEM下观察釉质形貌发现，使用电动牙刷刷牙会对釉质表面造成磨损，且硬度较大的尼龙丝刷头组造成釉质表面的凹陷越大越深越多，表面形态越粗糙。这说明，使用较软的电动牙刷刷头，对釉质的磨损较小，能够更好的保护釉质表面结构。

综上，在菌斑生物膜体外模型中，相对于传统手动牙刷，电动牙刷可更高效的去除牙面菌斑生物膜，不同硬度刷毛的电动牙刷的菌斑清除功效没有明显差异。且在使用电动牙刷刷牙时，软毛刷头对釉质表面的磨损较小，故使用软毛刷头电动牙刷对日常口腔保健有着更积极的作用。