花青素稳定性影响因素及改善方法研究进展

2020-04-08徐青王代波刘国华李冰晶周元敬

食品研究与开发 2020年7期

徐青，王代波，刘国华，李冰晶，周元敬

（1.贵州科学院生物研究所，贵州贵阳550009；2.贵州科学院分析测试研究院，贵州贵阳550000）

花青素（Anthocyanidin），又称花色素，是自然界广泛存在的一种水溶性天然色素，最早是从红葡萄渣中提取出来的葡萄皮红，并于1879年在意大利上市。随着研究的深入，人们发现在越橘、紫甘薯、黑醋栗、葡萄皮、紫茄果皮等中均含有丰富的花青素，其广泛分布于27个科，72个属的被子植物体的花、果实、种子和叶片中。花青素属于酚类化合物中的类黄酮类（flavonoids）化合物，具有抗氧化、抗癌症、抗炎症、抗衰老、抗肥胖、改善大脑功能、保护视力、保护心血管、保健皮肤和美容等方面的功效，在食品饮料、医药和化妆品等领域具有广阔的应用前景[1-4]。然而，天然的花青素是不稳定的，受本身结构和外界环境的影响而变质，对光照、温度、pH值、金属离子、氧化剂等因素敏感，使其的应用范围受到很大限制[5-6]。研究并提高花青素在加工和储存过程中的稳定性，从而拓宽其应用范围具有非常重要的意义。本文综述了花青素的稳定性研究概况，并分别从物理和化学两个角度重点探讨了提高花青素稳定性的处理方法和技术手段，以期为花青素的深入研究和产品开发提供参考。

1 结构和种类

花青素的结构如图1所示。

由图1可知，基本母核单元是2-苯基苯并吡喃，即花色基元（Flavylium）。绝大多数花青素在花色基元的3-，5-，7-位碳上有取代羟基，由于B环各碳位上所带羟基数（-OH）、甲基化（methylation）、糖基化（glycosylation）数目、糖种类和连接位置的不同而呈现不同颜色。自然界已知的花青素有22大类，500多种，其中最为常见的6种花青素分别为：矢车菊素或芙蓉花色素（Cyanidin）、飞燕草素或花翠素、翠雀素（Delphinidin）、天竺葵素（Pelargonidin）、芍药素（Peonidin）、牵牛素（Petunidin）和锦葵素（Malvidin），其具体结构和颜色如表1所示。

表1 6种常见的花青素Table 1 Six common anthocyanidins

这6种花青素占了总量的90%以上，它们在自然界中的分布比例分别约为50%、12%、12%、12%、7%、7%。其中矢车菊素、飞燕草素和天竺葵素分布最为广泛和普遍，80%的有色叶子、69%的果实和50%的花朵中都有存在[7]。

花青素一般以糖苷形式存在，常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通过糖苷键形成花色苷（Anthocyanin）。糖苷可取代 3，5，7 位，其中 3-糖苷最为常见。

2 花青素稳定性影响因素

花青素被公认为最强的天然抗氧化剂之一，是因为其具有缺电子的结构特征，极易受到活性氧负离子和自由电子的攻击。正因如此，使花青素具有较大的不稳定性且易发生降解作用。除了自身结构外，外界pH值、温度、光、金属离子、辅色素、食品添加剂等环境因素也会影响花青素的稳定性[8-9]。

2.1 结构的影响

从化学结构来看，花青素的母核单元缺少一个电子，其稳定性主要受结构中B环取代基的影响，羟基或甲基等供电子基团的存在会降低其稳定性，特别是在中性条件下最不稳定，反之则稳定性较好，因此天竺葵色素是最稳定的花青素[10]。研究发现，95℃热处理黑加仑提取液150 min，其中主要的4种花色苷热稳定顺序为：矢车菊素-3-芸香糖苷＞花翠素-3-芸香糖苷≈矢车菊素-3-葡萄糖苷＞花翠素-3-葡萄糖苷[11]。就糖基化而言，花色苷的稳定性受糖基的类型、数量及结合位点的影响。花青素糖苷基的羟基化会使花青素的稳定性降低，而糖苷基的甲基化、糖基化、酰基化都会增加花青素的稳定性；不同的糖基也会影响花青素的稳定性，按照葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的顺序依次降低[12]。

2.2 pH值的影响

在研究中发现，花青素作为一种水溶性色素，其颜色可随细胞液的酸碱度而改变，细胞液呈酸性则偏红，细胞液呈碱性则偏蓝。该现象说明花青素的稳定性受pH值影响较为明显，这是因为花青素的缺电子形态在环境pH值发生变化时受电荷的影响，其化学结构也相应发生变化。不同pH值下花青素化学结构和降解反应见图2。

如图2所示，花青素随pH值变化在黄盐阳离子、醌型碱、假碱、查耳酮4种形式之间发生可逆改变。当溶液的pH 1时，花青素主要以黄盐阳离子形式存在，溶液显紫色或红色；当pH值在2～4之间时，花青素失去C环氧上的阳离子变成蓝色醌型碱。醌型碱在酸性溶液中与黄洋盐阳离子间发生可逆转化；当pH值升高为5～6时，主要以假碱和查耳酮两种形式存在且二者也可发生可逆转化，溶液呈无色。即当pH值在4～6之间时花青素的4种不同结构形式共存，它们通过黄盐阳离子在醌基和甲醇基之间建立平衡，当pH值高于7时，花青素将被降解。因此，在强酸性条件下，花青素将以黄盐阳离子这一相对稳定的单一离子形式存在[13-14]。

图2 不同pH值下花青素化学结构和降解反应Fig.2 Chemical structure and degradation reaction of anthocyanidins at different pH

2.3 温度的影响

研究表明，无论在天然状态下还是实验室条件下，花青素的稳定性都会受到温度的影响。一方面，高温会促使花青素糖苷的水解，从而失去保护而降解；另一方面，高温会使花青素芘环水解产生白垩，这也是花青素受热变成棕色的原因[15]。野生状态下，25℃是蓝莓花青素最为稳定的一个温度，当温度逐渐升高到60℃时，花青素就会以查尔酮式结构存在，稳定性变得非常差，颜色也转为无色[16]。当花色苷溶液加热时，平衡向着无色查耳酮方向进行，同时引起有色型化合物的降低。当冷却和酸化时醌型碱和假碱迅速变成阳离子，但是查耳酮的变化相当慢，在25℃下3，5-二葡萄糖苷和3-葡萄糖苷的查耳酮型达到与其相应的黄洋盐阳离子的平衡分别需用12 h和6 h～7 h，而且温度越低需时越长。研究发现，花青素的受热降解为一级动力学反应[17]。

2.4 光的影响

光对花青素的影响有两个方面，一方面光照能够促进花青素的生物合成，另一方面光照能加速花青素本身发生降解[17-21]。谢程程的研究表明长时间光照会诱导花青素碳骨架在C2位上断开，形成C4羟基的降解中间产物，之后被氧化成查耳酮，而查耳酮进一步被氧化为苯甲酸及2，4，6-三羟基苯甲醛等终水解产物，从而导致花色苷被降解，颜色消退[17]。Ochoa等研究表明光使花青素的降解也符合一级动力学反应，在有光和避光条件下花青素的降解有显著差异[20]。

2.5 金属离子的影响

有研究表明，大多数金属离子是保护花青素稳定性的，展现出护色效果，不同颜色是因为金属离子与花青素黄洋盐离子形成的螯合物的作用产生的。金属离子的浓度以及护色对象不一样，其护色的效果也不一样。例如Ca2+、Cu2+、A13+等具有增色作用但其对花色苷的稳定性并没有显著的影响，而高浓度的Zn2+、Mg2+不仅具有增色作用，而且能够增加蓝莓花青素的稳定性。但并不是所有金属离子都会提高花青素的稳定性，如 Fe2+、Fe3+、Pb2+等对花青素具有破坏作用，使花青素的稳定性下降；Fe3+、Sn2+可使紫甘薯花青素溶液颜色加深并生成沉淀[22-23]。

2.6 食品添加剂的影响

食品添加剂也会对花青素的稳定性产生影响，且不同的食品添加剂影响程度也不一样。徐馨等研究了不同添加剂对火龙果皮红色素稳定性的影响，结果表明：茶多酚、没食子酸会破坏红色素的颜色，而柠檬酸、山梨醇、苯甲酸钠、抗坏血酸可一定程度上提高红色素的稳定性[24]。姚思敏蔷等研究发现木糖醇和丁基羟基茴香醚会使黑果枸杞中花青素溶液褪色，0.1%抗坏血酸会增加花青素颜色的稳定性，高浓度抗坏血酸起到反作用，没食子酸丙酯对花青素稳定性起保护作用，山梨酸钾和双氧水会破坏花青素类物质[25]。

3 提高花青素稳定性的方法

花青素的稳定性较差，其降解变质不仅发生在提取纯化的制备过程中，而且存在于存储、加工过程中。目前关于提高花青素稳定性的方法研究报道较多，本文分别从物理和化学两种方法进行阐述。

3.1 物理方法

3.1.1 常规手段

由于花青素的稳定性受pH值、温度、光等的影响显著，因此，在制备和储存过程中，应尽量保证pH值小于3、低温（＜60℃）、避光保存[26]。研究表明，为了保证蓝莓饮料中花色苷的稳定性，应以高温短时灭菌（121℃，10 s）和存储完整的标签包装[27]。蓝莓鲜果最好-18℃冻存；蓝莓果汁最好4℃贮藏，且酸度尽量调低，如调到pH 2.1，这样不仅可以保留更多的花青素，而且可以起到更好的抗氧化功效[11，28]。

3.1.2 添加辅色剂

辅色剂分子中通常含有丰富电子，这些电子与2-苯基苯并吡喃阳离子相互作用，避免水的亲核攻击，称为辅色效应，对花青素具有显著的稳定作用。辅色剂种类包括黄酮、生物碱、氨基酸、有机酸、核苷酸、多糖、金属离子以及花青素本身[29]。研究发现，L-色氨酸通过氢键和疏水相互作用可使含抗坏血酸体系中花青素的半衰期延长3.91 d[30]。在酚类和花青素共色作用中，电离电位是影响共色效果的决定性因素，电离电位越负，给电子能力越强，稳定效果越好[31]，Cruz等还认为酚类提升稳定性的效果与其分子立体结构有关，共平面的酚类如槲皮素、芦丁等的共色效果优于不共平面的酚类如儿茶素、表儿茶素等[32]。花青素本身属于多酚类物质，可通过芳香母核之间的疏水相互作用，形成垂直堆叠的分子复合物，使其稳定性增强，然而这种自缔合作用受浓度、溶液pH值、温度及溶剂等因素的影响比较明显[33-34]。

3.1.3 与有机大分子复合

花青素可通过氢键、静电效应和疏水效应等相互作用分别与蛋白质、环糊精、多糖等有机大分子形成复合物，从而提高其热稳定性和贮藏稳定性。研究表明，矢车菊色素-3-葡萄糖苷和牛血清白蛋白之间的复合，氢键是主要结合力[35]，复合后的矢车菊素-3-葡萄糖苷对光、热以及强氧化还原剂的稳定性显著提高，且具有更好的自由基清除能力和对铁的还原能力[36]。Wu研究发现甘露糖蛋白能与花青素通过疏水相互作用形成复合物，将花青素的热稳定性（pH 7.0，80℃或126℃热处理30 min）提高4倍～5倍[37]。

环糊精（cyclodextrin，CD）利用“外壁亲水、内腔疏水”的圆台形结构与花青素分子形成环糊精-花青素包结物，但其提高花青素稳定性的效果与环糊精和花青素的种类、溶液pH值等都有关[38]。Howard等的研究认为pH 3.6及3%的β-CD添加量对野樱莓花青素贮藏稳定性的提升效果最好[39]。Fernandes等的研究表明β-CD对矢车菊素-3-O-葡萄糖苷溶液颜色具有减褪作用，且这种作用随pH值增加变得越明显；而α-CD对它的溶液颜色却无显著影响[40-42]。

多糖与花青素的复合，根据分子种类、溶液pH值等因素的不同，对花青素稳定性可产生促进、降低和无影响3种情况[43]。如花青素通过与阿拉伯胶上的糖蛋白发生氢键作用形成复合物，从而可抑制饮料中抗坏血酸对紫胡萝卜花青素的降解[44]。Guan等通过疏水相互作用形成纳米尺度的复合物，可使pH 5.0的花青素溶液在80℃和126℃的热稳定性分别提高2倍和1.8倍[45]。阴离子型多糖卡拉胶能与花青素通过静电相互作用形成稳定的复合物[46]。

3.1.4 胶囊包埋

近年来，胶囊包埋在对食品活性成分的稳定化及生物利用度提升方面表现出巨大的潜力[47-48]。目前用于制备花青素胶囊的方法，主要包括离子交联法、乳化-热胶凝法、喷雾干燥以及冷冻干燥法等，包埋的体系主要有3类：微胶囊、脂质体（Liposomes）和聚合物纳米颗粒（Polymer nanoparticles）[49]。Ko等用芥子酸对黑大豆花青素进行辅色，采用离子凝胶法制备纳米胶囊后，花青素的颜色更稳定，抗氧化活性更有效[50]。He等用壳聚糖纳米颗粒包埋蓝莓花青素，纳米颗粒平均粒径219 nm，包埋的花青素在模拟胃肠液中降解缓慢，在模拟饮料中的储藏稳定性也明显提升[51]。

3.1.5 其他手段

韩成云研究发现，不同提取方法对紫薯花青素的稳定性影响不同，微波法提取的紫薯花青素热稳定性效果最佳，超声波法提取的紫薯花青素对pH值稳定性最佳[52]。Rabelo等将Acai浆果提取物制备成一种水包油的纳米乳液，可以显著提高花青素的保存率[53]。植物组织培养不仅可以提高花青素产量，还是增强花青素稳定性的有效途径。

3.2 化学方法

花青素通过化学方法进行修饰，往往具有更高的稳定性。这是因为花色苷中的糖苷基可与一个或多个分子的有机酸，主要有咖啡酸、阿魏酸、安息香酸、肉桂酸、丙二酸、葡萄糖酸等，通过酯键形成酰基化的花色苷[54-56]。酰基化可有效地阻碍花青素4种化学结构的转变，酰化作用的有机芳香酸或脂肪酸对花青素的稳定起到了很大的作用。花色苷中流动的糖链就像一条带子将折叠好的酰基缠绕在2-苯基苯并吡喃骨架的表面，这种堆积作用不仅对花青素具有保护作用，而且对系统的色泽稳定性具有积极的作用，称为花青素的“三明治”结构[57]。酰基平面碳链残基和花青素核之间疏水作用力形成层状结构，较好地保护了夹在两个有机酸中间的花青素核，使其能够较好地抵抗亲水攻击和其它类型的降解反应[58]。

对蓝莓花青素进行了一系列脂肪酸酰化修饰，对蓝莓花青素进行酰化前后的不同温度稳定性研究结果见图3。