王健 杨成龙 杨小雨

摘要 以薏苡黑穗病菌粉胞内蛋白为免疫原，制备抗体，建立薏苡黑穗病ELISA检测方法。结果表明，测定纯化后抗体的最高效价为1∶800 000，具特异性强;方阵试验测定抗原的最佳包被浓度为10.3 CFU/mL，抗体的工作浓度为1∶4 000;优化ELISA检测条件，确定抗体4 ℃过夜（8～12 h）包被效果最好，选择1%酪蛋白作为抗体的封闭液，抗体的最佳封闭时间为 1.5 h，抗体的最佳孵育时间为2.5 h，最佳底物作用时间为15 min;建立ELISA标准工作曲线，表明抗体的灵敏度为10.4 CFU/mL。ELISA检测田间采集的黑穗病病叶显示，抗体可与病叶提取液发生特异性反应，而与健康叶提取液呈阴性反应，由此可确定黑穗病的存在与否。该方法可用于田间薏苡黑穗病快速检测，以及时指导病害防治。

关键词 薏苡黑穗病;抗体;酶联免疫反应

中图分类号 S435.19  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）05-0197-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.056

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract The antibody was prepared by the immunogen with the intracellular protein in Coix lacrymajobi smut fungus powder， and the ELISA detection method was established. The results showed that the titer was 1∶800 000 of the purified antibody，which had high specific.The square matrix test to determine the optimal coating concentration of the antigen was 10.3 CFU/mL， and the working concentration of the antibody was 1∶4 000;the optimization ELISA detection conditions were antigen blocked for night （8-12 h） at 4  ℃， 1% cottomin of the assay buffer blocked for 1.5 h， antigen incubated for 2.5 h， the reaction time of coloration was 15 min. The standard curves of ELISA was established，which showed that the antibody sensitivity was 10.4 CFU/mL.ELISA detection of smut diseased leaves collected in the field showed that the antibody could be specific reaction with the extracted solution of disease leaves，and it be negative reaction with extracted solution of healthy leaves， which could confirm the presence or absence of smut.The method can be applied to detect cucumber bacterial white spot disease in field and direct the disease control in time.

Key words Coix lacrymajobi smut;Antibody;ELISA

薏苡（Coix lacrymajobi L.）是我國重要的药粮兼用的经济作物，具有极高的营养价值。薏苡在我国分布广泛，主产贵州、广西、云南、福建等省[1]。目前，贵州省薏仁米种植面积、产量均居全国第一，生产量占全国2/3[2]。贵州省各地薏苡种植分散，生产以农民自留当地农家种为主，种植区域没有实行合理布局，难以实现产业化、规模化，导致薏苡病害多发，尤其是由薏苡黑穗病最为严重，可使产量下降30%～50%，严重时减产80%[3-5]。

近年由于薏苡品种杂乱，导致黑穗病对薏苡的生长危害日趋严重，严重影响薏苡的产量和品质，对农户的经济收入造成严重的影响以及制约薏仁米产业的发展。对薏苡感黑穗病后建立快速检测的方法报道较少，而采用建立酶联免疫吸附剂测定（ELISA）技术检测早期薏苡感染黑穗病的方法鲜见报道，至1976年首次采用应用于植物病毒检测[6]后，该方法被用于植物、动物、医学上对病原菌及农药残留等快速检测的有效手段[7-9]，该技术方法为一类通过固相载体进行酶联免疫染色的免疫酶标，其特点具有特异性较强、高灵敏度、易操作、快速准确，对于生产上常规方法难以检测的病害具有独特优势。目前国内采用ELISA 技术成功检测各种病害，孙艳秋等[10]建立ELISA方法对黄瓜细菌性白枯病菌检测结果表明抗体的灵敏度为10.5 CFU/mL;Tsuchiya等[11]制备了番茄和辣椒细菌性斑点病菌的单克隆抗体;宁红等[12]用I-ELISA方法检测水稻细菌性条斑病菌，通过ELISA测定灵敏度可达10.3～10.4 CFU/mL。该研究以薏苡黑穗病菌菌丝蛋白作为免疫原，制备了多克隆抗体，并建立了快速灵敏的薏苡黑穗病ELISA检测体系，为进一步进行针对薏苡黑穗病的快速检测试剂盒的研究奠定了基础。

2.3 建立间接 ELISA 方法的标准曲线

将薏苡黑穗病菌粉配成不同浓度按“2.2.2”和“2.2.3”优化条件进行间接 ELISA 方法测定，以黑穗病菌粉液浓度对数为横坐标、抑制率为纵坐标绘制标准曲线，评价其灵敏度;检测结果显示（图6），薏苡黑穗病菌粉在60%～75%线性关系良好，即抗体的检测线性范围为 10.3～10.5 CFU/mL，所以该方法对薏苡黑穗病的检测灵敏度为 10.4 CFU/mL。

2.4 采用ELISA方法检测薏苡黑穗病病叶样品

采用ELISA 方法对薏苡黑穗病病叶的提取液进行检测，将提取液包被酶标板4 ℃过夜处理8～12 h后，以1%酪蛋白封闭液进行封闭处理，置于 37 ℃恒温箱中温育封闭l.5 h，加入薏苡黑穗病菌抗体和病叶提取液，再放入 37 ℃恒温箱中孵育 2.5 h，加入稀释4 000倍的HRP-羊抗兔IgG后再次放入 37 ℃恒温箱中孵育2.5 h，最终加入底物基质液反应15 min后终止反应并测定 OD490。结果表明（表2），病叶提取液的 P/N为 4.8，对照健康叶片提取液为阴性反应，表明建立的改良 ELISA 方法可准确检测出病叶中的薏苡黑穗病病菌。

3 小结与讨论

关于植物病原真菌的血清学检测中，一般可以将抗体分为2种，分别为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb） 是由一个B淋巴细胞产生，针对一种抗原决定簇的抗体[15]， 因具有特异性强、稳定性高、可无限量生产等优点，但真菌结构与物质组成极为复杂，寻找具有特异性抗原极其困难[16-17]。而多克隆抗体（polyclonal antibody，PAb）是由多种抗原决定簇刺激机体后相应地产生多种多样的单克隆抗体，把这些单克隆抗体组合在一起就称为多克隆抗体，虽其在某些情况下特异性不如单克隆抗体，但具有制备时间短、制备方法简单便捷、成本较单克隆抗体费用低的特点，所以仍被广泛研究和应用于生物、医学等领域对病原微生物的检测[18]。

近年来，在薏苡种植生产中存在的问题有品种单一、优良品种少、品种退化等问题日益突出，导致薏苡抗性差、病害多发，其中以薏苡黑穗病最为严重，严重制约了薏苡产业的发展，该病系由担子菌亚门黑粉菌属冬孢子引起的全株系统性真菌病害[3，19]，病斑最早出现在分蘖期的叶片上，一般在植株抽穗期病情大规模暴发，防治极其困难，对已发病的植株生产上暂无特效药剂进行防治，因此建立一套早期检测薏苡黑穗病的方法势在必行。目前，一般采用分子生物技术对一些常规病害进行检测，但因其成本高与使用精密的仪器，对操作者的要求较高，而且一般局限于实验室使用，而ELISA方法的操作相对简单快捷，具有特异性好、灵敏度高、成本低等优点，而且可以开发成试剂盒的形式，更适用于大规模田间样品的检测与基层推广。该研究以薏苡黑穗病菌菌丝与菌粉的胞内蛋白为抗原，获得了黑穗病菌的多克隆抗体，效价分别为1∶450 000与1∶800 000，具有非常理想的效价与特异性。目前已报道ELISA的灵敏度一般为10.5～10.6 CFU/mL，对于鉴定常规病害的病原菌是足够的[20]，该试验最佳的抗原抗体工作浓度已确定，并对各项反应条件进行初探优化，同时对建立的 ELISA 方法进行了薏苡黑穗病病叶的检测，采用10.4 CFU/mL对供试植物病原菌检测P/N为 4.8>2.1，而健康叶片呈阴性反应P/N<2.1，可见其特异性较好，结果准确可靠，为薏苡黑穗病快速诊断提供了有效的技术手段，具有良好的应用前景。

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