石骁昵　李婷　马宇熙

摘要：目的  研究超高效液相色譜-质谱联用（UPLC-MS/MS）法测定蔬菜中多菌灵含量的不确定度。方法  色谱柱为Waters ACQUITY BEH C18，1.7μm，柱温：35℃;进样量5 μl;流动相：A为乙腈，B为0.05%甲酸水;流速：0.3 ml。梯度洗脱条件：0～5 min 30% A，70% B;5～6 min 95% A，5% B;6～7 min 30% A，70% B，采用多反应监测模式进行检测，对不确定来源进行分析，建立标准曲线模型，计算各变量的不确定度、合成不确定度、扩展不确定度。结果  超高效液相色谱-质谱联用法测定蔬菜中多菌灵含量的不确定度，影响最大的是标准溶液配制稀释过程中产生的不确定度。相对不确定度为0.233，在置信度为95%时，覆盖因子k=2，扩展不确定度为4.66%。结论  UPLC-MS/MS法测定多菌灵含量对测量不确定贡献最大的是标准溶液的配制和稀释过程中产生的不确定度，其次是标准曲线拟合时产生的不确定度。因此在实验过程中要严格操作规程，减少人为误差。

关键词：多菌灵;蔬菜;超高效液相色谱-质谱联用;不确定度

中图分类号：TQ450.7                              文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.03.054

文章编号：1006-1959（2020）03-0162-03

Evaluation of Uncertainty in Determination of Carbendazim in Vegetables by UPLC-MS/MS

SHI Xiao-ni，LI Ting，MA Yu-xi

（Urumqi Center for Disease Control and Prevention，Urumqi 830026，Xinjiang，China）

Abstract：Objective  To study the uncertainty of determination of carbendazim in vegetables by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. Methods  The chromatographic column was Waters ACQUITY BEH C18， 1.7 μm， column temperature： 35 °C; injection volume was 5 μl; mobile phase： A was acetonitrile， B was 0.05% formic acid water; flow rate： 0.3 ml.Gradient elution conditions： 0～5 min 30% A， 70% B; 5～6 min 95% A， 5% B; 6～7 min 30% A， 70% B. Multi-reaction monitoring mode was used for detection. Analyze the sources of uncertainty， establish a standard curve model， and calculate the uncertainty， synthetic uncertainty， and expanded uncertainty of each variable.Results  The uncertainty of the determination of carbendazim in vegetables by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry combined with the most significant factor was the uncertainty generated during the preparation and dilution of standard solutions. The relative uncertainty is 0.233.When the confidence is 95%， the coverage factor k=2 and the expanded uncertainty is 4.66%.Conclusion  The most significant contribution to the measurement uncertainty of the determination of carbendazim by the UPLC-MS/MS method is the uncertainty generated during the preparation and dilution of the standard solution， followed by the uncertainty generated during the fitting of the standard curve. Therefore， it is necessary to strictly operate procedures during the experiment to reduce human error.

Key words：Carbendazim;Vegetables;Ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry; Uncertainty

在我国植物杀菌剂已广泛使用于水果蔬菜种植，其中多菌灵是一种广谱性杀菌剂，属于内吸性杀菌剂，通过吸收蔬菜体内产生代谢产物，从而起到杀菌作用。但多菌灵在人体内蓄积，可能引起呕吐等症状，且对生殖系统有很大影响[1]。多菌灵产生的积累性及生物毒性已经引起国家的重视，为了保证蔬菜质量安全，我国对农药残留实施了严格的检测，并对不同农作物有一定的限值要求[2，3]，这就对多菌灵检测结果的可信度和准确度提出了很高的要求。多菌灵的检测方法有高效液相色谱法、气相色谱法、气质联用法、高效液相色谱-串联质谱法[4-6]，但以上方法的适用范围较小，对于复杂基质的农药残留测定干扰较大。近年来随着检测技术的日益更新，超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS/MS）法在测定农药方面得到广泛应用[7-9]，UPLC-MS与MS联用，可以充分发挥两者的优势，与传统的高效液相色谱和质谱联用（HPLC-MS）相比，显著提高了定量分析的重复性和可靠性以及定性分析的准确性，较好地适应了现代药物研究对自动化、高通量分析的需求，已成为药物分析的重要方法之一[10]。本研究主要探讨超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS/MS）法测定蔬菜中多菌灵含量的不确定度，现报道如下。

1仪器与试剂

1.1仪器  Xevo-TQ-S Micro超高效液相色谱-质谱联用仪（美国Waters公司），AE240天平（瑞士Mettler），KQ-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），3-30KS冷冻离心机（德国Sigma公司），AH-20全自动均质器（睿科仪器有限公司），Milli-Q Integral 10超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2实验试剂  乙腈：色谱纯，德国Sigma公司;无水甲酸：色谱纯，天津光复精细化工研究所;无水硫酸镁、氯化钠：优级纯，天津市光复科技发展有限公司;PSA CNW;GCB，Agela Technoiogies;0.22 μm微孔过滤膜，安谱。多菌灵：Dr.Ehrenstorfer GmbH，纯度99.6%。

2方法

2.1样品前处理

2.1.1样品来源  市售绿叶蔬菜韭菜、茼蒿、叶用莴苣、油麦菜、小白菜共35份。

2.1.2样品前处理  称取5 g小白菜样品加入10 ml乙腈，充分震荡后超声10 min;加入1 g NaCl，再次充分震荡1 min，再加入4 g无水MgSO4迅速涡旋1 min。以10000 r/min冷冻离心10 min，取上清液1.0 ml，加入400 mg PSA，10 mg GCB，涡旋1 min，10000 r/min离心5 min，取上清液，过膜，上机测定。

2.2仪器条件

2.2.1质谱条件  离子源：ESI正离子模式;离子源温度：150℃;去溶剂气流量：1000 L/h;去溶剂气温度：450℃;锥孔气流量：50 L/h;监测方式：MRM模式，扫描采集参数：母离子：192.1 m/z;定量离子/碰撞能量：132.1/28 V;定性离子/碰撞能量：160/18 V;锥孔电压：33 V;保留时间：0.46 min。

2.2.2色谱条件  色谱柱为Waters ACQUITY BEH C18，1.7 μm，柱温：35℃;进样量5 μl;流动相：A为乙腈，B为0.05%甲酸水;流速：0.3 ml。梯度洗脫条件：0～5 min 30% A，70% B;5～6 min 95% A，5% B;6～7 min 30% A，70% B。

2.3标准溶液配制  称取10.04 mg Dr.Ehrenstorfer GmbH标准品，置于10.00 ml容量瓶，使用乙腈定容，配制成1 mg/ml多菌灵储备液。取1.00 ml储备液于100 ml容量瓶，用乙腈稀释配制为浓度为10 μg/ml的中间液。取中间液适量，用空白基质配制成测定浓度为0.5、1.0、5.0、10、20、40、80、100 μg/L的基质系列标准工作液。

3结果

3.1测定结果计算  本文中测定物质为多菌灵，其含量按以下公式计算：Xmg/kg=

注：X：待测物浓度（mg/kg）;C：样品中待测物浓度（μg/l）（仪器直读）;V：样品提取液体积10.00（ml）;M：样品质量5.00（g）。

3.2不确定度来源分析  影响不确定的因素有以下3个方面：①多菌灵标准品引入的不确定度，其中包括多菌灵标准品称量、稀释、定容引入的不确定度;②标准曲线的拟合引入的不确定度;③样品制备和测定以及回收率引入的不确定度[11，12]。

3.2.1多菌灵标准品称量引入的不确定度[ur （m ）]  根据本实验所用天平的检定证书，检定分度值e=0.1 mg，最大允许误差为0.5e，即为0.05 mg。按均匀分布，包含因子k=，标准品称量引起的不确定度为ur=，式中M为标准品称取量（mg），因此标准品称量引入的不确定度为ur （m ）=0.00287。

3.2.2标准溶液配制引入的不确定度[ur （C ）]  ①容量瓶引起的不确定度：配制标准溶液所需的容量瓶为10 ml和100 ml。根据本实验所用玻璃器皿的检定证书，其中10 ml（V1）A级容量瓶和100 ml（V2）A级容量瓶最大允许误差α均为±0.02ml，因质谱实验室温度控制恒定，故试剂及标准都在相同的环境条件下，可以忽略由温度引入的不确定度。按均匀分布，包含因子k时容量瓶引入的不确定度为ur （V ）=，x为容量瓶体积（ml），即10 ml容量瓶ur （V1 ）=0.001154，100 ml容量瓶引起的不确定度ur （V2 ）==0.000116。②移液器引起的不确定度：配制标准溶液所需的移液器量2～10 μl（p1），50～200 μl（p2），200～1000 μl（p3），根据检定证书移液器的允许误差α分别为±0.10 μl，±1.6μl，±8μl，按照均匀分布，k=，不确定度为分别为ur （p ）=，x为移液器最大量程（μl）。即3种移液器引入的不确定度分别为ur （p1 ）==0.005773，ur（p2 ）==0.004618，ur（p3 ）==0.004618。

由①②可得：在配制标准溶液时，使用1次10 ml容量瓶，2次100 ml容量瓶，2～10 μl移液器使用2次（1次5 μl，1次10 μl），50～200 μl移液器使用3次（1次50 μl，1次100 μl，1次200 μl），200～1000 μl移液器使用4次（1次400 μl，1次800 μl，2次1000 μl），其相对不确定度是：

3.2.3标准曲线拟合引入的不确定度[ur （b ）]  基质标准曲线共8个点（m=8），每个点测定3次，共测定24次，结果见表1。

共拟合3条标准曲线方程：a为标准曲线的斜率，b为标准曲线的截距平均值。三条曲线分别为y1=7282.72x+76548;y2=7466.96x+68572;y3=7346.91x+80467。b=75196， a=7358.86。

x为基质标准的理论平均值， x=32.0625，j为每组基质曲线的序号（j=1、2、3），i为测定基质标准溶液的序数（i=1，2，3……N）：自相关的方差为SXX=

3.3样品测量重复性和回收率引入的不确定度做一份空白样品的加标实验，加标量为0.10 mg/kg，每份样品测定6次，计算出多菌灵含量（mg/kg）及回收率（%）、相对标准偏差（%），结果见表2。

3.3.1回收率引入的不确定度[ur （R ）]u （R ）==0.390856，其中S（R）为回收率的标准偏差，回收率相对不确定度ur （R ）==0.004367，其中 R为回收率的平均值。

3.3.2样品重复性引入的不确定度[ur （y ）]ur （y ）==0.004789，其中S（X）为样品测定的标准偏差， X为样品测定平均值。

3.4合成不确定度  多菌灵测定的相对不确定度为：u=0.233095。

3.5相对扩展不确定度  置信区间95%，对于本实验包含因子选择k=2，则扩展不确定度U= ur（X）×k =0.46619。

4总结

使用UPLC-MS/MS测定蔬菜中的多菌灵含量，结果发现相对不确定度为0.233，在置信度为95%时，覆盖因子k=2，扩展不确定度为4.66%，小于16.8%的要求值。通过对以上各分量不确定度的研究，发现本实验中对测量不确定影响的最大分量是标准溶液的配制和稀释过程中产生的不确定度，其次是标准曲线拟合时产生的不确定度。因此在实验过程中，应加强对实验所用量器的检定，严格操作规程，减少人为误差，从而达到减小测定结果的不确定度，保证实验数据准确。

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收稿日期：2019-10-29;修回日期：2019-11-12

编辑/杜帆