金玲月 路晶晶 冯燕辉 张沁怡 吴寒 李容丹 黄薇 蓝灿华 田宝玉

摘 要：植物內生固氮菌能通过自身的固氮作用，把空气中的氮气转化为植物可利用的氨态氮，促进植物生长以及提高作物产量。以患根结线虫病的番茄根组织为材料，采用梯度稀释和划线法分离纯化番茄根内生菌，通过无氮固体培养基连续培养筛选固氮菌，并扩增固氮细菌的16S rRNA基因序列进行鉴定和系统发育分析，初步了解患根结线虫病的番茄根内菌的种类和分布。结果表明，在挑选和分离纯化得到的33株番茄根内生菌中，经过在无氮培养基平板上连续的传代培养，最终得到3株具有稳定固氮能力的内生菌株。分子鉴定和序列分析表明筛选出的内生固氮菌菌株中包括8株芽孢杆菌、1株黄单胞菌和1株根瘤菌。与先前发表的番茄根内生菌优势OTU的聚类分析结果表明，根瘤菌是患根结线虫病番茄根中优势的内生固氮菌种群。

关键词：根结线虫;番茄根;内生固氮菌;筛选;分子鉴定

中图分类号：S641.2 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2020）12-0046-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.12.009

Screening， Identification and Phylogenetic Analysis of Endophytic Nitrogenfixing Bacteriain Tomato Roots Infected with Rootknot Nematode

JIN Lingyue1， LU Jingjing1， FENG Yanhui1， ZHANG Qinyi1， WU Han1，LI Rongdan1， HUANG Wei1，2， LAN Canhua1， TIAN Baoyu1*

（1. College of Life Sciences， Fujian Normal University/Key Laboratory of Fujian University of Cellular Stress

Response and Metabolic Regulation， Fuzhou， Fujian 350108， China; 2. Institute of Agricultural Quality Standards

and Testing Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： The endophytic nitrogenfixing bacteria could transform the nitrogen in the air into ammonia nitrogen available for the plants through their own nitrogen fixation， thus to promote the plant growth and increase the crop yield. By using the tomato root tissue infected with the rootknot nematode as the material， the endophytic bacteria in tomato roots were isolated and purified by the methods of gradient dilution and streaking. The nitrogen fixing bacteria were screened by the continuous culture in the nitrogenfree solid medium. Then， the 16S rRNA gene sequence of nitrogenfixing bacteria was amplified for the identification and phylogenetic analysis， thus to explore the species and distribution of endophytic nitrogenfixing bacteria in tomato roots infected with the rootknot nematode. The results showed that the three endophytic strains with stable nitrogen fixation ability were obtained after continuously subculturing the selected and purified 33 strains of endophytic bacteria in tomato roots in the nitrogenfree culture-medium. The molecular identification and sequence analysis showed that there were 8 strains of Bacillus， 1 strain of Xanthomonas and 1 strain of Rhizobium in the selected strains of endophytic nitrogenfixing bacteria. The cluster analysis of the dominant OTU of endophytic bacteria in tomato roots previously published indicated that Rhizobium was the dominant population of endophytic nitrogenfixing bacteria in tomato roots infected with the rootknot nematode.

Key words： Rootknot nematode; Tomato roots; Endophytic nitrogenfixing bacteria; Screening; Molecular identification

植物内生菌是指在植物生活史的某一阶段，能在植物组织内检测到但不会引起明显植物组织病变的一类微生物[1-2]。常见的植物内生菌包来源有两种，一种是植物体内固有的，随着植物有性或无性繁殖方式进行传播。另一种是从植物体表或外界环境经吸附、侵染最终成功定殖于宿主植物体的内生菌[3]。植物内生菌与宿主在长期共同进化过程中，形成了互利和相互依存的关系，在植物的生长、发育、健康、产量、养分吸收以及抗病性等方面发挥着重要的作用[2，4]。植物内生菌可用作为生物防治中潜在的微生物杀虫剂，以及促进植物生长的微生物肥料等。

植物内生固氮菌是指定殖在植物内部与植物宿主联合固氮的固氮菌，是植物内生菌中最受关注的类群之一[5-8]。植物内生固氮菌占据着适合植物组织营养供应和微环境的生态位，可有效拮抗病原微生物的生长，并且相较于根外环境，更有利于形成高效的固氮系统，能够促进作物生长以及提高产量[8，9-11]。氮素是植物需求量最大的营养元素，是合成蛋白质的主要来源，对植物生长发育至关重要[12]。固氮菌能通过自身的固氮作用，把空气未能被植物吸收的氮气转化成氨态氮，成为植物可以直接利用的氮肥。除固氮之外，固氮菌还能能够促进农作物生长发育，增强其他根际微生物的生命活动，促进土壤有机物质的矿化作用，改良土壤结构，改善作物质量[13-14]。近年来，已有研究发现水稻[15]、小麦[16]、甘蔗[17]、大豆[18]、马铃薯[19]、玉米[20-21]等作物的内生固氮菌在促生、抗病害等方面具一定作用。

先前研究发现根结线虫侵染的植物根结内固氮细菌高度富集[22]。本课题以被线虫侵染的番茄根组织材料为研究对象，分离纯化获得根内生菌，并从中筛选出具有固氮菌能力的内生固氮菌，初步确认患根结线虫病的番茄根内生固氮菌的优势菌株，为挖掘植物内生固氮菌菌株资源，深入研究分析内生固氮菌与作物共生关系以及根结线虫的相互作用关系提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

根结线虫侵染的番茄植株采集于福建省福州市福建师范大学校园实验田。

1.2 培养基

1.2.1 固体培养基 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）：胰蛋白胨15.0 g，大豆蛋白胨5.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂15.0 g，pH 7.3±0.2，以蒸馏水定容至1 L，121℃高压灭菌30 min备用。

无氮固体培养基：甘露醇（或葡萄糖）10 g，磷酸二氢钾0.2 g，七水合硫酸镁0.2 g，氯化钠0.2 g，二水合硫酸钙0.2 g，碳酸钙5 g，琼脂粉20 g，pH 7.0±0.2，以蒸馏水定容至1 L，121℃高压灭菌30 min备用。

1.2.2 液体培养基 胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB），胰蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，氯化钠5.0 g，磷酸氢二钾2.5 g，葡萄糖2.5 g，pH 7.3±0.2，以蒸馏水定容至1 L，121℃高压灭菌30 min备用。

1.3 试验方法

1.3.1 番茄根根组织样品处理 收集根结线虫侵染的番茄植株根，自来水冲洗后，用无菌水冲洗3次。根表面消毒采用5%次氯酸钠消毒1 min，无菌水冲洗3次，再用75%酒精消毒1 min，无菌水冲洗3次。将已消毒的根部组织研磨成匀浆并连续稀释至10-5，分别吸取100 μL涂布于TSA固体培养基，37℃培养18～24 h，观察平板菌落数以保证菌落大小合适挑选。

1.3.2 番茄根内生菌的分离纯化 根据稀释平板上菌落的形态、大小和颜色，挑取不同的单菌落并在TSA固体培养基平板上划线，确保每个菌株得到单一纯化的菌落，挑取单菌落进行二次划线分离。将分离的菌株分别接种于2 mL的TSB液体培养基，37℃摇床培养18～24 h，菌液按终浓度20%的比例加入甘油进行保种，于-80℃冰箱保存。

1.3.3 番茄根内生固氮菌的筛选 挑取少许上述培养好的番茄根内生菌菌液，按每个菌株3个平行分别接种于无氮固体培养基平板上，37℃培养24～48 h，定期观察菌落的生长状况。在无氮固体培养基平板上上生长的菌株（即子一代）再次接种于无氮固体培养基上，生长的菌株记为子二代，以此类推，继续培养到子五代。传代培养到子二代仍能在无氮固体培养基上生长且生长状态良好的菌株可以初步判定具有固氮能力的内生菌，传代五代仍能生长且生长状况良好的菌株可判定其具有较稳定的固氮能力。

1.3.4 番茄根内生菌16S rRNA基因的PCR扩增、鉴定和系統进化树构建 采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取番茄根内生菌的基因组DNA，并以提取的基因组DNA为模板，以细菌通用引物27F：5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′和1492R：5′TACGGCTACCTTGTTACGACTT3′进行PCR扩增细菌16S rRNA基因。PCR反应条件：95℃预变性5 min;94℃变性45 s，62℃退火45 s，72℃延伸90s，循环30次;72℃延伸7 min。扩增产物用QiagenQiaquick柱试剂盒纯化回收，并送至上海生工进行双向测序，获得的序列用SeqMan查看并进行序列拼接，在EzBioCloud数据库进行分析确定其分类地位。

从已发表番茄根微生物组菌群分析结果中抽提丰度最高的前50个OTUs序列，并与3株确定的固氮酶菌株的16S rRNA基因序列合并，使用SeaView 5的ClustalX程序按默认参数进行比对和对齐[22-23]，在Mega中采用邻位相连算法进行系统发育树的构建[24]。

2 结果和分析

2.1 番茄根内生菌的分离纯化

根据菌落形态、大小和颜色差异从TSA固体培养基中分别挑选单菌落进行划线纯化，为了保证得到纯化的单克隆菌落，再次挑选单菌落进行二次划线，最终得到33株纯化的番茄根内生菌菌株并保种。

2.2 番茄根内生固氮菌的筛选

将分离纯化的33株番茄根内生菌菌株分别接种于无氮固体培养基上培养，生长的菌株（即子一代）再次接种于无氮固体培养基上，进行二次传代培养。经过两次传代培养后，有10株番茄根内生菌可以在无氮培养基上生长（如表1所示）。将初步判定具有固氮能力的10株番茄内生菌继续进行传代培养，最终得到3株具有稳定固氮能力的番茄根内生菌固氮菌J26、J55和J58（表1）。

2.3 番茄根内生固氮菌的分子鉴定

分别提取番茄根内生固氮菌株的基因组DNA并扩增细菌16S rRNA基因，PCR产物纯化后送公司测序，测序结果拼接后递交EzBioCloud数据库进行分子鉴定。从鉴定结果（表2）可知，在10株初步认定具有固氮能力的内生菌株中，其中有8株细菌菌株，包括J15、J18、J20、J26、J33、J34、J56和J58属于芽孢杆菌类;另外菌株J51属于黄单胞菌属，J55属于根瘤菌属。经过进一步的筛选，最终确定Lysinibacillus capsici J26、Rhizobium larrymoorei J55、L. fusiformis J58等3株菌株传代培养到子五代仍能在无氮培养基平板上正常生长，最终确定这3株菌株为番茄根内生固氮菌菌株。

2.4 番茄根内生固氮菌菌株的比对和系统发育分析

从先前已经发表的健康和患根结线虫病番茄根内生菌菌群分析结果中抽提丰度最高的前50个OTUs的序列，并将其与确定为番茄内生固氮菌的3株菌L.capsici J26、R.larrymoorei

J55、L.fusiformis J58的16S rRNA基因序列合并，使用SeaView的ClustalX程序将所有序列进行编辑比对对齐，在Mega进行NJ系统发育树的构建。聚类分析结果（图1）发现，菌株

J55与患根结线虫病番茄根微生物中的OTU_32 Rhizobium聚在一起，并且与OTU_34 Rhizobium和OTU_18 Rhizobium聚在同一个分枝，这些OTUs在分类上均属于根瘤菌细菌，并且在番茄根微生物组中有较高的丰度。结果表明根瘤菌是患根结线虫病番茄根微生物中的优势内生固氮菌菌群。在番茄根内生微生物中丰度最高的前50个OTUs中与L.capsici J26和L.fusiformis J58 聚在一起的为OTU_47 unclassified，但在聚类关系上亲缘关系较远，序列同源性较低（<97%）。

3 讨论

根结线虫（Meloidogyne spp.）是宿主分布最为广泛、对植物危害最严重的植物寄生线虫之一[25]。近些年研究表明，植物内生菌在防治植物病害方面有着非常重要的作用[26]。与根际、叶际其他的益生微生物相比，内生固氮菌的固氮作用可使宿主植物更为受益，同时也在分泌生长素促进植物生长、溶磷和增强植株抗病性、抗逆性等方面的发挥重要作用，在农业实践中作为微生物菌肥应用广泛[27]。番茄根结线虫病一般发生在番茄的须根和侧根上并生成根结，其与主要与豆科植物共生且产生于主根的根瘤明显不同[26，28]。本课题组在前期研究中发现根结线虫侵染的番茄根结内固氮细菌高度富集[22]。目前尚无患根结线虫病的植物根组织中固氮菌种类和分布的研究。因此本试验对根结线虫侵染的番茄根内生固氮菌研究，可以进一步为探索内生固氮菌与根结线虫侵染相互作用奠定基础。

本试验通过两轮的传代培养从分离纯化的33株番茄根内生菌中初步筛选得到10株可以在无氮培养基上生长的内生菌。经过进一步的连续传代培养，最后确定了3株具有稳定固氮能力的内生固氮菌菌株。一些最初被认定为具有固氮能力的细菌菌株在后续的筛选中无法进一步在无氮培养基上生长的主要原因可能是这些细菌本身并不具有固氮能力，而是利用了起始液体培养基中残留的氮源物质。随着传代次数的增加，残留的氮源被消耗。所以在固氮菌的筛选中连续传代培养是排除假阳性结果必不可少的环节。最终确定的3株内生固氮菌，其中2株芽孢杆菌类菌株J26、J58，1株根瘤菌类菌株J55在传代培养中表现出稳定的固氮能力，菌株J55与患根结线虫病番茄根微生物中的高丰度OTU_32 Rhizobium聚在一起，进而表明根瘤菌是患根结线虫病番茄根微生物中的优势内生固氮菌菌群。

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（責任编辑：柯文辉）