宋冉

疫情之下，基因疗法赛道持续火热。有业内人士认为，基因疗法即将“引领生物医药的第三次产业革命”，会成为继化学小分子药物、生物大分子药物之后的第三代治疗药物。

不过，基因治疗始终绕不过的一道坎就是递送，递送技术是打开基因治疗大门的“钥匙”。

常用的递送工具有 AAV、LNP、外泌体等，其中 AAV 是基因治疗临床上最常用的载体技术，也是 FDA 批准上市的基因治疗药物中最安全的病毒载体之一。现在，有超过2/3的基因疗法公司都在使用 AAV 作为递送工具。究其本原是因为 AAV 是非致病性的，而且可以有效靶向组织和器官。

然而，正如硬币的正反面一样，AAV 亦有其两面性，正所谓成也病毒，败也病毒。有临床试验数据显示，基因治疗载体 AAV 会引起强烈的天然免疫反应，这可能会降低治疗效果，甚至引发严重的副作用。2020 年发生了3例由于高剂量用药而引发的基因疗法致死案例，虽然现在还没有证据证明始作俑者是免疫原性，但是却引发了人们对于 AAV 载体安全性的担忧。

George Church 教授及其学生Ying KaiChan

过度免疫反应是基因治疗的一大挑战，科学家们一直在寻求优化和改进 AAV 载体，降低免疫反应。

近日，由“当代基因组学教父” George Church 领衔的哈佛团队在 Science Translational Medicine 发表了一项 AAV 载体的最新研究。研究显示，他们利用“偶联免疫调节”（coupled immunomodulation）开发了一种“更安全”的 AAV 载体，这种经工程化修饰的 AAV 载体可以明显减少炎症和 T 细胞反应，同时改善小鼠和猪模型中的基因表达。

Ying Kai Chan 告诉生辉：“ 在基因疗法临床试验中，减低或者消除免疫反应难题的常用策略是服用免疫抑制性药物，包括全身用糖皮质激素或者减少病毒载体中的 CpG。我们的方法利用了合成生物学思维，采用了‘即插即用的方式，将人体内发挥免疫监视作用的基因片段插入 AAV 载体 DNA 序列中，帮助 AAV 实现‘隐身。”他是 George Church 的学生，也是这项研究的第一作者。

George Church、Ying Kai Chan 等成立了一家基因疗法公司 Ally Therapeutics，专注于破解 AAV 免疫原性难题，开发“更安全”的 AAV 载体及其基因疗法。

Crunchbase 的数据显示，公司成立伊始，便获得了美国生命科学领域知名风投机构 Arch Venture Partners、Alta Partners，和企业战略风险投资基金 UCB Ventures 的种子轮融资。

给 AAV 穿上“隐身衣”

模式识别受体 —— Toll 样受体（TLR）是一类跨膜受体，在机体免疫活动中扮演重要角色。目前，在哺乳动物中共发现了 11 个 TLR 家族成员，其中机理较为清楚的是 TLR2、TLR4、TLR5 和 TLR9。

基因治疗先驱詹姆斯威尔逊（James Wilson）最先证明了当 AAV 载体进入人体细胞中，人体可以通过一组 TLR 对 AAV 做出反应。可以说 TLR 是 AAV 载体进入人体细胞后引发过度免疫反应的“幕后推手”。

具体来说，当 AAV 载体进入人体细胞后，体内抗原提呈细胞 DC 细胞、巨噬细胞等，通过模式识别受体 TLR9、TLR2 等检测识别 AAV 载体上的病原体相关分子模式，并激活下游的相关信号通路，诱导炎症和致敏等过度免疫反应。比如血液中的浆细胞样 DC（pDC）、肝脏中的库普弗细胞（Kupffer cell）的 TLR9 可以识别 AAV 基因组核酸。

詹姆斯威尔逊把 TLR 比作是天然免疫的“哨兵”，TLR 能够监视与识别各种不同的病原体相关分子模式（PAMP）。这些“哨兵”是免疫系统的第一道防线，如果它们发现任何抗原，就会立刻发出警报。这就意味着，正常细胞需要一种方法来告诉 TLR 受体自己是安全的，无需启动防御系统。

George Church、Ying Kai Chan 等哈佛团队正是通过抑制 TLR9 的激活，实现了 AAV 载体的 “隐身 ”。

在研究中，我们以“即插即用 ”的方式 TLR9 抑制序列整合到 AAV2 血清型病毒载体中，当 AAV 进入体内后，这些基因序列会与体内的 TLR 受体结合，并告诉这些受体无需启动免疫警报系统，这样就相当于给 AAV2 穿上了‘隐身衣。这种‘隐身的 AAV 也可以称为 AAV2.0，进入体内后可以减轻天然免疫和炎症反应，甚至增加有效载荷的表达。

在论文中研究人员们写道：“这种‘偶联免疫调节策略可以实现‘即插即用，可能为不同的 AAV 基因治疗提供一种通用的、广泛适用的解决方案，同时也不会影响衣壳或载体基因组元件等。”

Ying Kai Chan 还向媒体透露，他们研究小组将修饰后的 AAV 注射到猪和小鼠模型的肌肉，肝脏和眼睛中后，AAV 引发的免疫反应比传统载体明显减少。

哈佛大学的研究小组认为，在动物模型中令人鼓舞的结果表明了抑制 TLR9 可以生產更安全、更有效的 AAV 载体，从而避免 AAV 基因组引发的免疫应答。

不过在猴子身上的表现并不明显。该研究团队将这种载体注射到了非人灵长类动物的眼睛中，在视网膜下给药时，显示出了更高的安全性;直接注射到猴子玻璃体腔内时，仍然引发了明显的炎症反应。“挑战仍然存在。”Ying Kai Chan 说。

Ying Kai Chan 在接受外媒采访时还表明，新论文只是其修饰 AAV 的 1.0 版，此后他们还对 AAV 进行了重大改进。

诚然如此，AAV 还有很长的路要走。比如说，动物模型仍然不能很好地预测人类免疫反应，在安全性试验中还存在很大的漏洞。在猴子身上表现出免疫沉默的载体仍可能引发人体免疫反应，反之亦然。尽管 AAV 在动物体内的作用已有充分文献记载，但仍不清楚 TLR 在人体内对 AAV 反应中所扮演的角色。

现在，Ally Therapeutics 将利用 TLR9 编辑的 AAV 技术平台，寻求开发免疫原性较低的基因疗法。

降低免疫原性的其他方式

有业内相关人士表示，AAV 作为一种常用的递送工具，需要特别关注以下几点。第一，一定要降低免疫源性，避免人体中和抗体对它的清除;第二，必须要有非常高的组织特异性，才能够把病毒内的核酸正常递送到组织细胞的表面;第三，转导率，病毒的转导率取决于递送内容有多少能够进到细胞内部。

衣壳蛋白和基因组都是 AAV 免疫原性成分，AAV 的衣壳蛋白决定了其对不同组织的靶向性及免疫原性，也有不少科学家通过改造衣壳蛋白的方式降低 AAV 的免疫原性。

经工程化改造的 AAV 衣壳蛋白

拥有 DNA 合成和测序背景的埃里克·凯尔西奇利用 AI 系统优化并筛选 AAV 衣壳，其搭建的 AI 技术平台可以对一种特定 AAV 血清型的所有衣壳变体进行高通量筛选。其创立的基因疗法公司 Dyno Therapeutics 正在基于其 AI 筛选平台开发更安全的“下一代”基因治疗载体。

而马赛诸塞州眼耳医院基因治疗中心的负责人卢克范登伯格则持有不同的看法。据了解，卢克范登伯格曾经尝试了埃里克凯尔西奇利用 AI 优化 AAV 衣壳的方式，但是失败了。因此，他对于埃里克凯尔西奇是否有足够的知识用通过 AI 改造优化 AAV 衣壳蛋白表示怀疑。

“该领域在开发携带大片段基因以及躲避中和抗体的载体方面能力很薄弱”。卢克范登伯格说。

他创立的基因疗法 Affinia Therapeutics 目前正在利用专有的 AAV 文库和技术改造病毒衣壳蛋白的免疫原性和组织定向性，治疗领域集中在中枢神经疾病和肌肉疾病。

而 George Church、Ying Kai Chan 使用的方式不同，他们的方法只是将抑制性 TLR9 基因片段整合到了 AAV 载体中，不会影响衣壳或载体基因组元件。哈佛研究团队认为，抑制 TLR9 这一路径可能在解决 AAV 基因疗法引发的高免疫原性问题中扮演更为重要角色。

有业内人士预言，2021 年将会是“细胞基因治疗年”。作为基因治疗的“命门”，AAV 仍是当下基因递送工具中的最优解。无论是 AAV改造衣壳蛋白还是其基因组，进一步提高AAV的安全性和有效性将会被是未来基因治疗公司需要不斷演算的一道必答题。（摘自美《深科技》）（编辑/多洛米）