董 鹏，李小红，王俊红，刘超峰2，王玉环，张春虹

血管并发症是糖尿病的主要并发症，高血糖加速动脉粥样硬化发生，动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要原因[1-2]。对糖尿病病人来说选择一种能有效降糖，同时又能对抗动脉粥样硬化药物具有重要的临床意义。利拉鲁肽是一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，有研究表明，其具有抗动脉粥样硬化作用[3-4]，且利拉鲁肽能有效减少糖尿病人心血管事件的发生[5-8]；相关报道表明，利拉鲁肽能抑制血管平滑肌增殖，延缓动脉粥样硬化发生[9-10]。课题组前期研究发现，GLP-1类似物利拉鲁肽能有效减少平滑肌细胞KCa3.1蛋白表达。在链尿菌素(STZ)诱导的小鼠模型中，利拉鲁肽抑制平滑肌增殖的作用可能与激活腺苷酸活化的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)通路有关[10]。目前利拉鲁肽对糖尿病平滑肌KCa3.1与AMPK通路关系研究报道较少。本研究拟根据前期研究，探讨对糖尿病大鼠模型利拉鲁肽是否通过AMPK通路抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及KCa3.1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器 血管紧张素Ⅱ(阿拉丁，A107852)，血管紧张素(索莱宝，I8830)，利拉鲁肽Liraglutide(selleck，S8256)，Dorsomorphin (Compound C)(selleck，S7840)，达尔伯克(氏)必需基本培养基(DMEM)，高糖(Hyclone)，血清(CIBCO)，Anti-alpha smooth muscle Actin抗体(abcam，ab124964)，TRITC荧光二抗(Jackson分装)，Hoechst 33342(碧云天，1︰5 000稀释)，Fast Start Essential DNA Green Master(Roche，06924204001)，TRIZOL(Invitrogen，15596026)，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，K1622)，RIPA裂解液(强)(西安赫特生物科技有限公司，WB00920)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(bioworld，AP0063)，KCNN4抗体(proteintech，60276-1-lg)，Kv1.3(proteintech，14079-1-AP)，AMPK抗体(abcam，ab32047)，磷酸化AMPK(PAMPK)抗体(abcam，ab133448)，细胞计数试剂盒-8(CCK8)(上海七海复泰生物科技有限公司，C008)，PVDF膜(Millipore)。

1.2 平滑肌细胞制备

1.2.1 大鼠VSMCs的分离与原代培养 SPF级雄性SD大鼠3只，体重约150 g，处死大鼠，在无菌条件下迅速取出全段胸主动脉，将血管转移到含DMEM(10%胎牛血清)的无菌平皿中，使用DMEM培养液清洗中膜层平滑肌数次后，以眼科弯剪剪切成约1 mm 三大组织块；……