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鸡血抗菌肽对保育猪生长及其免疫调节的研究

2020-03-30佘锐萍刘天龙

中国兽医杂志 2020年11期
关键词:抗菌肽补体口蹄疫

刘 辉 , 佘锐萍 , 刘天龙 , 刘 波

(中国农业大学动物医学院 , 北京 海淀 100193)

血液抗菌肽是从动物的血红蛋白α或β亚基上裂解而来的片段,具有抗菌等多种活性的水解产物[1]。其分子由15~30个氨基酸残基组成,分子量低(不足10 kDa)。血红蛋白抗菌肽是阳离子抗菌肽,呈现α螺旋构象,在水溶液或十二烷基硫酸钠液体以随机线圈形式存在[1-3]。这些特性决定了它们在微浓度下具有广泛抑制微生物的能力[4-5]。血红蛋白抗菌肽的作用方式是提高细胞膜的通透性[6-7]。

鸡血抗菌肽(Chicken blood antimicrobial peptides,CBAP)属于天然的禽源抗菌肽,是从鸡新鲜血液中提取出大小为3.3 kDa鸡血红蛋白α链片段,被证明有广谱的抗菌活性及家禽免疫调节与抗应激的功能[8]。抗菌肽(AMPs)对哺乳动物免疫力的重要性往往被低估,首先在植物和无脊椎动物中发现抗菌肽具备强大的免疫功能,随着对哺乳动物天然免疫防御系统研究不断深入,AMPs在哺乳动物免疫中的重要作用得到确认。在微生物病原体的刺激下,动物的细胞在感染或损伤局部部位释放AMPs[9]。除了抑制微生物生长外,某些AMPs还可以直接募集白细胞或诱导趋化因子与细胞因子的分泌,从而间接促进单核细胞、巨噬细胞、未成熟树突状细胞和T细胞等效应细胞的募集。募集作用是通过与G蛋白偶联受体介导的,将树突状细胞和T细胞招募到微生物入侵的部位,从而促进细胞免疫反应[10]。AMPs还可以调节动物的适应性免疫。如防御素作为有效的免疫佐剂,通过诱导淋巴因子的产生,促进T细胞依赖性细胞免疫和抗原特异性免疫球蛋白的产生[11]。

本次试验重点探索CBAP对猪的促生长与免疫调节作用影响,为开发绿色无抗促生长添加剂提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与耗材 CBAP是由本实验室按照酶解法从新鲜鸡血中提取所得,pH=6.0±0.5,浓度为300 μg/mL。猪外周淋巴细胞分离试剂盒,购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司;进口胎牛血清,购自Nobimpex公司;DMEM,购自赛默飞世尔公司;1×PBS缓冲液(pH 7.2~7.4),购自Solarbio公司;脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)、WST-8细胞技术试剂盒,均购自北京钮因华公司;猪补体C3、C4 ELISA试剂盒、猪γ-干扰素ELISA试剂盒,均购自Dogesce公司;猪伪狂犬病(Porcine pseudorabies,PR)gB抗体ELISA检测试剂盒,购自Biochek公司;经典猪瘟(Classical swine fever,CSF)抗体ELISA检测试剂盒,购自美国爱德士公司;猪口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)O型、A型液相阻断ELISA检测试剂盒,均购自金宇保灵生物药品有限公司。

1.2 主要仪器 无菌超净台,美国Labconco公司产品;低速离心机LD5-2,北京医用离心机厂产品;倒置式生物电子显微镜,北京东南仪诚公司产品;紫外分光光度计,Bio-rad公司产品;II级生物安全柜,山东博科生物产业有限公司产品;CO2细胞培养箱,Thermo公司产品;BKQP-100L立式高压蒸汽灭菌器,山东鑫贝西公司产品;电热恒温培养箱,北京陆希科技有限公司产品。

1.3 实验动物 65日龄美系纯种杜洛克猪,购自北京六马集团。

1.4 试验方法

1.4.1 试验时间与地点 2019年8月8日—2019年9月8日,共30 d,试验地点为北京六马集团顺义猪场。

1.4.2 试验设计 根据体重、健康状况等同性原则随机分为2组,每组10头,对照组10头(基础日粮),CBAP组10头(基础日粮+300 μg/mL、10 mL/d CBAP饮水)。CBAP通过10 mL的注射器(去掉针头)直接注入猪的口腔里,饲料为干湿料,每天早、中、晚各加料1次,饲养试验为30 d。考虑阳光因素,2组试验都有阳面和阴面。基础日粮为六马集团生产加工的保育料,保育猪采用地面栏舍饲养,试验期保持猪舍卫生、消毒。免疫按照猪场管理流程执行,试验猪舍要适当通风,保持猪舍安静。免疫程序见表1。

表1 保育猪免疫程序Table 1 Immunization program for nursery pigs

1.4.3 生长指标的测定 试验过程中,每天观察猪群2~3次,记录保育猪腹泻与死亡情况。(1)日增重:分别在试验的第1天、第30天,早晨7:30左右空腹逐头进行称重,计算出试验期间仔猪的日增重。试验期日增重/头=(试验末栏平均重-试验初栏平均重)/试验天数;(2)平均日采食量:以栏为单位,每栏每天总采食量,连续相加30 d,再求平均值。平均日采食量=采食量/饲养天数;(3)死亡率:30 d内死亡头数/每栏总头数×100%;(4)饲料料肉比=头平均采食量/头平均日增重;(5)腹泻头数:每天查看猪群状态,统计腹泻发病情况与数量。

1.4.4 免疫指标测定 (1)在试验第0、10、20天和第30天各组分别对固定的5头猪(准备屠宰)进行采血,分离血清,标记好,4 ℃保存,一并测定猪瘟(CSF)、狂犬病(PR)、猪口蹄疫(FMD)3种抗体和细胞免疫指标(血清补体C3、C4,γ-干扰素);(2)采集8头猪的脾脏,制作脾淋巴细胞,测定淋巴细胞转化率。抗体检测与脾淋巴细胞提取按照试剂盒说明书步骤完成。

1.5 数据分析 使用Graphpad prism 8.0软件进行显著性差异分析与图表绘制,以P<0.05为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 CBAP对保育猪生长指标的影响 使用CBAP对猪群进行30 d的饲喂,如表2与图1所示,试验末平均体重,CBAP组比对照组多3.42 kg,增重了8.2%,差异显著(n=10,P<0.05)。CBAP组的平均日增重比对照组多88 g/d,提高了13.7%,差异显著(n=10,P<0.05)。CBAP组料肉比与对照组相比下降0.18,下降了10.4%,差异显著(n=10,P<0.05)。 说明CBAP对猪群的生长有很好的促进作用,在采食量大体一致的情况下(1 050 g/d vs 1 103 g/d), CBAP组有更好的饲料转化率。从控制腹泻角度来说,对照组在试验期间共出现4头腹泻猪只,而CBAP组只有1头,差异显著(n=10,P<0.05)。说明CBAP对控制猪群腹泻效果较为明显,这可能与维持猪群肠道健康有关。

图1 CBAP对保育猪生长指标的影响Fig.1 Effect of CBAP on growth indexes of nursery pigs*:P<0.05,差异显著; 无标记:P>0.05,差异不显著;下同*:P<0.05,the difference was significant; No marker:P>0.05, the difference was not significant. The same as below

表2 CBAP对保育猪生长指标的影响Table 2 Effects of CBAP on growth indexes of nursery pigs

2.2 CBAP对保育猪血清中免疫指标的影响 在试验第0、10、20天和第30天分别采集对照组和CBAP组各5头猪血清,测定补体C3、C4、γ-干扰素。结果见图2。血清补体C3(n=5)的结果见图2A,在第20~30天的CBAP组血清补体C3浓度显著高于对照组(P<0.05),而在试验开始到20 d,CBAP组与对照组差异不显著(P>0.05);血清补体C4(n=5)的结果见图2B,与C3结果一致,也是在第20~30天 的CBAP组中的血清补体C4浓度显著高于对照组(P<0.05)。 其他时间效果与对照组不显著(P<0.05)。 γ-干扰素结果如图2C,在第10天及第20天2个时间点CBAP组与对照组差异都不显著(n=5,P>0.05),而在试验第30天CBAP组猪血清中的γ-干扰素明显高于对照组(P<0.05)。

图2 CBAP对保育猪天然免疫指标的影响Fig.2 Effect of CBAP on innate immune indexes of nursery pigsA:血清补体C3; B:血清补体C4; C:γ-干扰素A:Serum complement C3; B:Serum complement C4; C:Interferon-γ

2.3 CBAP对保育猪脾淋巴细胞增殖的影响 饲喂CBAP 30 d,猪淋巴细胞增殖作用结果如图3所示,由ConA刺激的T淋巴细胞的转化率(n=4)的结果显示,CBAP组要极显著高于对照组(P<0.01),由LPS刺激的脾B淋巴细胞增殖作用(n=4)显示,CBAP组要极显著高于对照组(P<0.01),与T淋巴细胞的转化率结果一致。

图3 猪脾淋巴细胞转化试验Fig.3 Lymphocyte transformation test of pig spleen

2.4 CBAP对保育猪体液免疫指标的影响 试验期的第0、10、20天和第30天分别采集对照组和CBAP组各5头猪只血清,检测猪瘟,伪狂犬gB,口蹄疫O型、A型抗体,具体结果如下:CBAP对猪瘟疫苗的效果如中插彩版图4A所示,与对照组相比,CBAP对猪瘟的抗体效价与合格率均无明显改善,差异不显著(n=5,P>0.05),这可能由于CBAP对活猪瘟疫苗病毒有一定的影响,导致对疫苗抗体效果提高不明显。CBAP对猪伪狂犬疫苗的效果如中插彩版图4B所示,与对照组相比,在第30天gB抗体效价差异显著(n=5,P<0.05),其他时间段差异不显著。CBAP对伪狂犬灭活苗产生抗体有很好的促进作用。CBAP对猪口蹄疫疫苗O型抗体的效果如中插彩版图4C所示,本场口蹄疫疫苗第1次免疫在60 d,第2次免疫在90 d,饲喂CBAP 30 d后,CBAP组对猪口蹄疫O型抗体滴度有明显的改善作用,在第10天CBAP组抗体滴度极显著高于对照组(n=5,P<0.01);在第20天与第30天采血检查,CBAP组抗体滴度显著高于对照组(n=5,P<0.05)。CBAP对猪口蹄疫疫苗A型抗体的效果如中插彩版图4D所示,试验期间的第10天与第30天CBAP组要明显优于对照组,抗体效价差异极显著(n=5,P<0.01)。第20天CBAP组显著高于对照组,抗体效价差异显著(n=5,P<0.05)。说明CBAP可很好地促进口蹄疫A型抗体产生。

3 讨论

3.1 抗菌肽对猪群的促生长作用 抗生素作为动物饲料促生长添加剂已有50多年的历史。然而,饲料中抗生素增加动物机体产生耐药性机会,天然抗菌肽不但可以促进动物生长,提高各项免疫指标,且作用稳定,安全可靠,是理想的促生长添加剂替代品。本次试验选用大保育猪作为研究应用对象,体重在20 kg以上,每天每头饲喂300 μg/mL、10 mL/d,经过1个月饲喂周期,与对照组相比,日增重提高了13.7%,料肉比下降了10.4%,腹泻率下降了30%。表现出较好的促生长和抗腹泻效果。

3.2 抗菌肽对猪群的免疫促进作用 抗菌肽的免疫增强活性一直是研究的热点之一,其独有的双重平衡机体特性,可以直接通过抗菌活性和刺激固有免疫功能(炎症、伤口修复和适应性免疫系统的调节)保护宿主免受潜在有害病原体的侵害。同时,还保护机体免受过度炎症反应的有害影响。本试验从下面两个方面讨论抗菌肽与免疫的关系。

3.2.1 抗菌肽与天然免疫 补体(Complement,C)是血浆蛋白的正常组成成分,存在于人与动物血浆中一组无活性的分泌蛋白和膜结合蛋白前体。激活补体系统过程中,会产生多种活性分子参与机体的抗感染免疫,调节细胞与体液免疫效应,介导炎症反应。血清中补体C3、C4含量反映机体的免疫水平。王静(2007年)研究发现,饲喂抗菌肽粗提的肉鸡,21日龄血清补体 C3、C4含量要明显高于对照组[12]。本试验使用CBAP饲喂猪群30 d后发现,在试验第10天时,CBAP组猪的血清补体C3、C4含量逐步要高于对照组,在第20~30天,试验组的C3、C4含量要显著高于对照组,这说明抗菌肽对补体系统有很好的促进作用,这与王静的研究结果相一致。γ-干扰素由活化T细胞和自然杀伤细胞产生,具有较强的免疫调节功能。它可以调节T、B淋巴细胞的功能,小剂量时起促进作用,大剂量却表现为抑制。本试验对饲喂CBAP的猪群血清进行γ-干扰素检查发现,对照组相比,饲喂CBAP组在第30天γ-干扰素明显高于对照组。脾淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞与体液免疫水平,本次试验饲喂30 d CBAP后,各组取4头猪的脾脏,分离淋巴细胞,用ConA作为T淋巴细胞有丝分裂原,用LPS作为B淋巴细胞有丝分裂原,刺激测定细胞转化率结果发现,对照组相比,CBAP组的对T、B淋巴细胞转化率均极显著地提高(P<0.01)。说明CBAP可以有效缓解动物的免疫抑制。

3.2.2 抗菌肽与体液免疫 AMPs不但可以调节先天性免疫,而且对适应性免疫也有很好的促进作用。将卵清蛋白(OVA)与α-防御素HNP1-3联合应用于小鼠,与单独使用OVA相比,联合使用可以增加OVA的IgG抗体水平[13]。蜂毒肽(Melittin)是一种24个氨基酸的多肽,存在于蜂毒中,具有很强的疫苗佐剂活性。使用这种肽结合破伤风类毒素(TT)或白喉类毒素(DT)抗原鼻腔免疫小鼠,血清抗TT和抗DT IgG明显高于单独接种抗原小鼠[14]。这可能是由于AMPs通过诱导共刺激分子促进IDCs的成熟,在APC与抗原接触时来调节淋巴细胞反应,改变细胞因子的表达,导致抗原摄取增加。从而促进更有效的抗原提呈及后续更强大的T细胞活化。但要考虑抗菌肽自身的免疫原性,因此建议使用短肽(<15氨基酸)作为免疫佐剂。本次试验发现CBAP对猪瘟抗体效果不显著,这可能是由于猪瘟是弱毒疫苗,有囊膜,CBAP对其也有一定的杀灭或者抑制体内增殖作用。因此影响了其抗体的产生,但CBAP也对免疫有一定促进作用,最后结果表现出差异不显著。本试验中猪伪狂犬第2次免疫采用的是灭活疫苗,CBAP对其抗体的产生有明显的促进作用。口蹄疫O、A抗体与伪狂犬一致,在抗体效价上,CBAP组要明显优于对照组(P<0.05)。根据本次试验发现,CBAP对弱毒苗效果不是很理想,但对灭活苗的效果比较好。

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