田晴，高丹美，李慧，刘守伟，周新刚，吴凤芝

（东北农业大学园艺园林学院，哈尔滨 150030）

0 引言

【研究意义】西瓜（Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum & Nakai）是我国用量较大的水果之一，其在农业生产中具有重要的经济地位[1]。在现代集约化农业系统中，为了追求作物产量和效益的最大化，西瓜连作现象普遍存在。单作系统中，特异性土壤病原菌的积累是西瓜产量损失的重要原因。小麦是禾本科作物，具有较强的化感作用，其产生的化感物质有异羟肟酸和酚类化合物[2]。研究小麦根系分泌物对连作西瓜土壤中特异性菌群、真菌群落结构和多样性的影响，探明根系分泌物对连作土壤微生物环境的改善作用，对西瓜枯萎病的生态防治和菜田土壤的健康保持具有重要的理论意义。【前人研究进展】研究发现，多样化的管理实践（如间作和轮作）可以缓解连作引起的负面影响，间作小麦增强了西瓜对枯萎病的抗性[3]。间作抑制作物病害的机制可能与根系分泌物和土壤微生物有关[4-5]。不同植物分泌的物质并不完全相同，所以植物多样性的变化改变了土壤中根系分泌物的数量和类型[6]。旱稻的根系分泌物可以改变西瓜根际土壤中微生物的多样性，增加根际土壤中放线菌的丰度，同时降低真菌的丰度和病原菌的活性[7]。根系分泌物可通过改变微生物的结构和多样性间接抑制病原体的生长[8-9]，也可以直接抑制病原菌[10]。土壤微生物在维持农业生态系统中发挥着重要作用[11]。尖孢镰刀菌属和木霉菌属都是丝状的子囊真菌[12]，木霉菌可以增强植物对病原体的防御能力，并促进植物生长[13-14]。此外，木霉菌属中的某些物种（例如T.asperellum（T-34））是尖孢镰刀菌的生物控制剂[15]。尖孢镰刀菌属中存在致病性和非致病性物种，致病性物种可以感染许多植物并导致作物维管束阻塞，引起植株萎蔫[16]。【本研究切入点】在植物多样性的种植体系中，土壤中根系分泌物的数量和类型会发生改变从而改变土壤中的微生物[6]。体外试验研究发现小麦根系分泌物对西瓜专化型尖孢镰刀菌有抑制作用[17]。例如水稻根系分泌物中有香豆酸而没有阿魏酸，西瓜根系分泌物则与之相反[18]。目前西瓜幼苗根系分泌物和小麦根系分泌物在西瓜土壤中对微生物相互作用的研究还比较少。前期研究发现，伴生小麦可以减轻西瓜枯萎病的发生[19]，这与小麦根系分泌物密切相关[4]，但小麦根系分泌物是如何调控真菌群落以及有益微生物来抑制植物病原菌的还不得而知。【拟解决的关键问题】本研究利用荧光定量和高通量测序技术，研究外源添加小麦根系分泌物对西瓜连作土壤中真菌群落的结构和多样性的影响，为揭示根系分泌物对微生物群落变化规律的影响提供理论依据，也为间作缓解病害的发生提供科学依据。

1 材料与方法

试验于2018年1—7月东北农业大学设施工程中心日光温室和园艺园林学院蔬菜生理生态实验室进行。

1.1 试验材料

供试土壤类型为北方黑土，取自连作3茬西瓜土壤（采用5点取样法，取其耕层0—15 cm的土混合均匀备用），其铵态氮30.82 mg·kg-1，硝态氮25.37 mg·kg-1，速效磷246.31 mg·kg-1，速效钾256.00 mg·kg-1，有机质30.60 g·kg-1，pH 7.21（1∶2.5，土∶水），EC值1.08 ms·cm-1（1∶2.5，土∶水）。西瓜品种为‘黑美人’（感病品种），购于种子公司。小麦（Triticum aestivumL.）品种为D123，由笔者课题组提供。

1.2 试验设计

1.2.1 小麦根系分泌物的收集 将从东北农业大学设施工程中心塑料大棚中采集闲置4年的土壤（0—15 cm）混合均匀，然后装入15 cm×13.5 cm的塑料盆中，每盆装土900 g。每盆播种105粒小麦种子，常规管理。待小麦苗高20 cm左右时，将小麦的根系取出，先用自来水冲洗，再用去离子水清洗，将小麦苗置于盛有0.5 mmol·L-1CaCl2的去离子水溶液的塑料杯（500 mL）中，烧杯外包裹锡纸避光。在光照培养箱中培养6 h，取出根后得到的就是小麦根系分泌物[20]。先后用布氏漏斗和两层0.45 μm滤膜过滤。将根系表面的水分吸干，并对根系称重。依据前期的研究发现小麦根系分泌物的浓度在（1 g/10 mL）时，对西瓜专化型尖孢镰刀菌的抑制作用最大[4]。因此，用含0.5 mmol·L-1CaCl2的去离子水溶液定容根系分泌物至1 g根鲜重/10 mL[21]。密封，放于-80℃冰箱中备用。

1.2.2 试验处理设计 将西瓜连作土壤装入15 cm×13.5 cm的塑料盆中，每盆装西瓜连作土壤900 g。试验设置有西瓜苗外源添加小麦根系分泌物（WR）、无西瓜苗外源添加小麦根系分泌物（NR）、有西瓜苗外源添加含CaCl2的去离子水溶液（WC）和无西瓜苗外源添加含CaCl2的去离子水溶液（NC）4个处理。每个处理6盆，3次重复，随机排列，常规管理。不喷施药剂，不施加化肥，人工除草。

1.3 试验方法

西瓜常规育苗，待西瓜生长至三叶一心时定植于装有西瓜连作土的栽培盆中，每5 d用收集到的小麦根系分泌物对西瓜进行灌根处理，即分别在西瓜缓苗后的第0、5、10、15、20、25、30和35天将收集的小麦根系分泌物浇灌到每个盆中，每盆浇灌20 mL到西瓜根部，模拟小麦根系分泌物的作用。西瓜缓苗后的第40天采集不同处理的土壤。以每个处理6盆土壤的混合样作为一个样本，即每个处理有3个重复样本。将收集到的土壤样本过2 mm筛后保存在-80℃冰箱中，用于土壤DNA的提取。

1.3.1 土壤总DNA的提取 取0.25 g土壤样品，用Power Soil® DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories，CA，USA）按说明提取DNA。对每个土壤样品平行提取3次，提取到的溶液混合后待用。用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的土壤DNA。使用NanoDrop ND-1000 UV-Vis分光光度计（Thermo Scientific，Rockwood，TN，USA）检测提取物的DNA浓度和质量（A260/A280）。

1.3.2 qPCR 在IQ5实时PCR系统（Bio-Rad Lab，LA，USA）中测定土壤微生物的丰度。总真菌、木霉菌、尖孢镰刀菌和西瓜专化型尖孢镰刀菌分别使用引物ITS1F/ITS4[22]、UtF/UtR[23]、FnSc-1/FnSc-2[24]和Fon-1/Fon-2[24]。

1.3.3 高通量测序 用Illumina MiSeq测序分析土壤真菌群落的组成。用引物ITS1F/ITS2R扩增真菌rRNA的ITS1区域[25]。使用mothur软件处理获得的DNA序列。用USEARCH v7.1去除嵌合序列。用UPARSE将具有97%相似性的独特序列聚类到操作分类单元（OTU）中。使用含有真菌核糖体RNA序列（版本119）的SILVA数据库对序列进行分类。

1.4 数据分析

试验原始数据的整理采用Microsoft Excel（Office 2016）软件完成。对于Illumina MiSeq测序数据，用Mother（version v.1.30.1）计算Chao1、ACE、Shannon和Inverse Simpson的多样性指数。对于Beta多样性分析，基于Bray-Curtis距离用“R”中的“vegan”作PCoA图，研究样本群落组成的相似性或差异性。用Origin8.5软件做柱形图。基于Tukey在0.05概率水平上的真实显著性差异（HSD）进行处理之间的平均比较。

2 结果

2.1 小麦根系分泌物对西瓜连作土壤真菌群落多样性的影响

2.1.1 对真菌群落α多样性的影响 无苗添加小麦根系分泌物处理的Shannon指数和Inverse Simpson index低于其他处理（P＜0.05）。无苗添加小麦根系分泌物（NR）处理的ACE显著低于处理WR（P＜0.05）。无苗对照（NC）的Inverse Simpson index显著低于有苗对照WC（P＜0.05）（图1）。

2.1.2 对土壤中总真菌、木霉菌、尖孢镰刀菌和西瓜专化型尖孢镰刀菌丰度的影响 有西瓜苗添加小麦根系分泌物（WR）和无西瓜苗添加小麦根系分泌物（NR）的处理均降低了真菌和尖孢镰刀菌的菌群丰度（图2-a，c），且无西瓜苗添加小麦根系分泌物的土壤（NR）中尖孢镰刀菌的菌群丰度高于有西瓜苗添加小麦根系分泌物的处理（WR）（图2-c）。有西瓜苗添加去离子水（WC）总真菌的菌群丰度高于无西瓜苗添加去离子水（NC）（图2-a）。有西瓜苗添加小麦根系分泌物（WR）和无西瓜苗添加小麦根系分泌物（NR）的处理均增加了木霉菌的菌群丰度，并且有西瓜苗添加小麦根系分泌物（WR）的木霉菌菌群丰度较高（图2-b）。有西瓜苗添加小麦根系分泌物（WR）的处理降低了西瓜专化型尖孢镰刀菌的菌群丰度（图2-d）。

图1 小麦根系分泌物对真菌群落α多样性的影响Fig.1 Effects of wheat root exudates on α diversity of fungal communities

2.2 小麦根系分泌物对西瓜连作土壤真菌群落结构的影响

2.2.1 在门水平上对土壤真菌群落结构的影响在各处理土壤中，子囊菌门（Ascomycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、接合菌门（Zygomycota）和担子菌门（Basidiomycota）是主要的真菌门（平均相对丰度＞1%），占真菌序列的94%以上。在无西瓜苗处理中，外源添加小麦根系分泌物增加了Chytridiomycota的相对丰度，但降低了Zygomycota和Basidiomycota的相对丰度。有西瓜苗的处理（WC和WR）中，Chytridiomycota和Zygomycota的相对丰度分别高于无西瓜苗处理（NC和NR）。无苗添加小麦根系分泌物的处理（NR）中Ascomycota的相对丰度高于有西瓜苗的处理（WC和WR）（图3-a）。

2.2.2 在纲水平上对土壤真菌群落结构的影响 在纲水平上，粪壳菌纲（Sordariomycetes）、盘菌纲（Pezizomycetes）和壶菌纲（Chytridiomycetes）占真菌序列的78%以上。在无苗处理中，小麦根系分泌物处理中Sordariomycetes和Chytridiomycetes的相对丰度高于对照，但Pezizomycetes和银耳纲（Tremellomycetes）的相对丰度低于对照。小麦根系分泌处理（NR和WR）中Dothideomycetes的相对丰度高于对照处理（NC和WC）。有西瓜苗的处理（WC和WR）中Sordariomycetes和散囊菌纲（Eurotiomycetes）的相对丰度高于无苗处理（NC和NR），但Pezizomycetes、Dothideomycetes和Tremellomycetes的相对丰度低于无苗处理（NC和NR）（图3-b）。

图2 小麦根系分泌物对总真菌（a）、木霉菌（b）、尖孢镰刀菌（c）和西瓜专化型尖孢镰刀菌（d）丰度的影响Fig.2 Effects of wheat root exudates on the abundances of total fungi (a), Trichoderma spp.(b), Fusarium spp.(c) and Fusarium oxysporum f.sp.niveum (d)

图3 小麦根系分泌物对西瓜连作土壤真菌门（a）和纲水平（b）的影响Fig.3 Effects of wheat root exudates on the phylum (a) and class (b) level of fungal in watermelon soil

2.2.3 在属水平上对土壤真菌群落结构的影响 在属水平上（平均相对丰度＞1%），Kernia、Chaetomium、Fusarium和Acremonium是主要的分类群（平均相对丰度＞16%）。无苗添加小麦根系分泌物的处理（NR）中Acremonium的相对丰度高于无苗对照处理（NC），但无苗添加小麦根系分泌物的处理（NR）中Humicola、Mortierella、Cephaliophora和Cryptococcus的相对丰度低于无苗对照处理（NC）。有苗对照处理中Chaetomium和Alternaria的相对丰度低于有苗添加小麦根系分泌物处理（WR），而Fusarium和Podospora的相对丰度高于有苗添加小麦根系分泌物处理（WR）。与有西瓜苗的处理（WC和WR）相比，无苗添加小麦根系分泌物的处理（NR）增加了Acremonium和Rhizophlyctis的相对丰度，但是降低了Chaetomium、Fusarium、Humicola、Mortierella、Podospora和Aspergillus的相对丰度（P＜0.05）（表1）。

表1 小麦根系分泌物对西瓜连作土壤真菌主要属水平的影响Table 1 Effects of wheat root exudates on the genus level of fungal in watermelon soil

2.2.4 对真菌OTU水平的影响 在OTU水平上，大部分的OTUs（平均相对丰度＞1%）主要属于子囊菌门。在无西瓜苗的土壤中，在添加小麦根系分泌物的处理中属于Acremonium和Rhizophlyctis的2个OTUs的相对丰度较高；在没有添加小麦根系分泌物的处理中属于Cephaliophora、Cryptococcus、Acremonium和Mortierella的5个OTUs相对丰度较高。在有西瓜苗的土壤中，添加小麦根系分泌物的处理中属于Chaetomium和Mortierella的2个OTUs的相对丰度较高（P＜0.05）；在没有添加小麦根系分泌物的处理中属于Fusarium和Podospora的3个OTUs的相对丰度较高（表2）。

在所有处理中检测到13个OTUs属于尖孢镰刀菌属，3个OTUs属于木霉菌属（平均相对丰度＞0.01%）。OTU168、OTU595、OTU327、OTU307、OTU917和OTU1129分别属于F.solani、F.brachygibbosum、F.sp、F.delphinoides和T.virens。在尖孢镰刀菌属中，WC处理中OTU322、OTU168和OTU307的相对丰度高于其他处理。在木霉菌属中，WC处理中OTU917的相对丰度高于其他处理（表3）。

表2 小麦根系分泌物对西瓜连作土壤真菌主要OTU水平的影响Table 2 Effect of wheat root exudates on the OTU level of fungal in watermelon soil

2.2.5 对真菌的PCoA分析 PCoA（Principal coordinates analysis）结果表明不同处理中西瓜连作土壤的真菌群落存在差异（图4）。在土壤真菌群落中PC1的贡献率为85.86%，PC2的贡献率为8.43%。每个处理的3个重复聚在一起，说明真菌群落结构的样品重复较好。有苗处理（WC和WR）和无苗处理（NC和NR）在PC1上分开，相距较远。无苗处理和有苗处理中，小麦根系分泌物与去离子水（含CaCl2）处理在PC2上分开。说明外源添加小麦根系分泌物和有无西瓜苗的处理在土壤真菌群落组成上存在显著差异。

3 讨论

根系分泌物进入土壤后可以被土壤微生物快速的分解[26]。因此，需要定期的将小麦根系分泌物施加到土壤中。根系分泌物对微生物在土壤中的分布具有重要的作用[27]。在本研究中，小麦根系分泌物改变了西瓜连作土壤中真菌群落结构和多样性，这与之前的研究结果一致[28]。无苗且添加小麦根系分泌物处理中真菌的菌群丰度最低，而有苗添加去离子水的处理中真菌的菌群丰度最高。表明小麦根系分泌物可以抑制真菌的丰度，而西瓜根系分泌物可以促进真菌的丰度，这是由于根系分泌物的成分不同造成的[29]。无苗且添加小麦根系分泌物的处理中真菌群落的丰富度和多样性最低，而有西瓜苗的处理中真菌群落的丰富度和多样性较高，这可能是由于西瓜根系分泌物中的某些物质可以诱发微生物增殖并在根际积累。

表3 小麦根系分泌物对西瓜连作土壤中尖孢镰刀菌属和木霉菌属群落结构的影响Table 3 Effects of wheat root exudates on the community structure of Fusarium and Trichoderma spp.in watermelon soils

图4 小麦根系分泌物对西瓜连作土壤真菌的主坐标分析（PCoA）Fig.4 Effects of wheat root exudates on the principal coordinate analysis of fungi in watermelon soil

作物根系中的碳代谢物可以被土壤微生物同化，所以土壤微生物会受到碳资源的限制[30]。在该项研究中，小麦根系分泌物增加了与纤维素降解相关物种的相对丰度，如Chaetomium[31]、Acremonium[32]和Aspergillus[33]；但降低了有致病潜力的物种，如Fusarium[34]、Humicola[35]和Mortierlla[36]的相对丰度。研究表明，微生物与小麦根系分泌物的相互作用改变了真菌群落的结构和丰度，更有利于作物的生长[37-38]。此外，小麦根系分泌物降低了Cephaliophora[39]，Podospora[26]和Cryptococcus[40]的相对丰度，它们具有促进植物生长和抑制植物病原体的作用。间作系统有较多的有益微生物和较少的病原微生物，并能引起微生物群落结构的变化[41]。因此，小麦根系分泌物诱导的西瓜连作土壤中有益微生物的增加和病原微生物的减少可能是间作系统抑制土传病害的原因之一。

在许多生态系统中发现木霉菌是一种有益的真菌，它可以分泌各种化学物质来抑制病原真菌的生长[13]。在本研究中，小麦根系分泌物增加了木霉菌属的多样性，并改变了其群落组成。与无苗处理相比，有西瓜苗的处理中增加了木霉菌的丰度，并且添加小麦根系分泌物的处理中木霉菌的丰度更高。这些结果表明，小麦和西瓜的根系分泌物都可以促进木霉菌的丰度，但是在小麦和西瓜根系分泌物的共同作用下木霉菌的丰度最高。这是因为小麦和西瓜根系分泌物都对木霉菌属物种有促进作用[42]，且西瓜根系分泌物的某些成分可作为木霉菌的化学诱导剂[43]。木霉菌属的许多菌株可以抑制植物病原体，减少植物病害的发生，并分泌针对真菌细胞壁的裂解酶[44]，比如，Trichoderma koningii的生物防治活性可以控制小麦的全腐病[45]。小麦根系分泌物引起的木霉菌属的变化可以单方面地解释间作对植物病害的抑制作用。

尖孢镰刀菌从根部伤口或从根毛顶端细胞间侵入，在维管束导管内生长发育，阻塞导管，影响水分输送，引起植株萎蔫和分泌毒素，干扰寄主代谢功能，使寄主中毒死亡[46]。研究发现，水稻根系分泌物可以抑制尖孢镰刀菌孢子的萌发和生长，增强了西瓜对尖孢镰刀菌的抗性[47]。本研究发现，与无苗处理相比，有苗处理降低了尖孢镰刀菌的丰度，并且在添加小麦根系分泌物的处理中尖孢镰刀菌的丰度最低，在添加去离子水的处理中西瓜专化型尖孢镰刀菌的菌群丰度最高。这些结果表明，西瓜根系分泌物对尖孢镰刀菌有促进作用，而小麦根系分泌物对尖孢镰刀菌有抑制作用。此外，小麦根系分泌物降低了Fusarium solani和Fusarium delphinoides的相对丰度，它们二者都是植物病原体，可以在多种植物上引发各种疾病[18,48]。这些结果表明，小麦根系分泌物可以抑制植物病原菌。

4 结论

小麦和西瓜根系分泌物改变了总真菌、木霉菌和尖孢镰刀菌的群落组成。小麦根系分泌物降低了土壤中真菌、尖孢镰刀菌和西瓜专化型尖孢镰刀菌的菌群丰度，增加了木霉菌的菌群丰度，且有西瓜苗添加小麦根系分泌物处理中木霉菌的丰度最高，尖孢镰刀菌的丰度最低；而西瓜根系分泌物与之相反。说明在西瓜和小麦根系分泌物的共同作用下对有益微生物的扩繁作用和对有致病潜力的微生物抑制作用最大。小麦根系分泌物诱导的西瓜连作土壤中真菌群落的变化是小麦/西瓜减缓西瓜病害的原因之一。