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窖泥高产己酸菌的分离筛选及发酵性能测试

2020-03-28赵晨婕王超凯孙中理常少健

中国酿造 2020年1期
关键词:己酸老窖乙醇

赵晨婕 ,刘 念,王超凯,李 觅,孙中理,常少健,余 航,潘 明

(1.四川轻化工大学 生物工程学院,四川 自贡 643000;2.四川省食品发酵工业研究设计院,四川 成都 611130)

窖泥是固态浓香型白酒产酸呈味、产酯生香等微生物的栖息地,是酿造白酒风味的基础[1-2],富集了种类繁多、功能各异的酿酒微生物菌群[3-4]。有研究发现,老窖中厌氧型细菌的种类及数量均多于新窖[5],这些细菌对白酒中香味物质的形成起着重要作用,是老窖产好酒的重要原因[6]。己酸菌是重要的窖泥产酸功能菌,其代谢产生的己酸与大曲发酵产生的乙醇生成己酸乙酯[7-8],形成浓香型大曲酒的主体香成分,决定着浓香型白酒的质量及风格[9]。己酸菌的细胞形态有梭状、短杆状或长杆状,分为专性厌氧、耐氧性和好氧性菌[10]。

1964年,轻工部茅台试点组从窖泥中成功筛选出了己酸菌[11],在此研究基础上,1975年,内蒙古轻工所采用纯培养的方法也从老窖泥中筛选出了己酸菌,同时对己酸菌的培养方法进行了研究[12]。在己酸菌的生理代谢研究方面:沈怡方[13]经过一系列试验后发现,当培养基中缺乏乙醇时,易使丁酸的含量增加,若在培养基中增加淀粉类碳源时,易使己酸的含量降低,丁酸含量增加。在己酸菌培养的改进方面:杜礼泉等[14]使用不锈钢罐培养、改进了培养基成分(去掉了钙类物质);娄虹等[15]采用了固定化方法培养己酸菌;王瑞明等[16]采用絮凝技术提高了培养液中己酸菌的数量。杜礼泉等[17]解决了己酸菌在培养过程中发臭、变黑的问题。目前大多数酒厂多应用窖泥富集菌液改善酒质,但在突出浓香型白酒的呈香风格上效果不明显[13,18],因此筛选出高产己酸的菌株具有极其重要的意义。

本研究通过对老窖泥多次富集培养从中筛选高产己酸的菌株,通过形态观察及分子生物学技术对其进行鉴定,并对其中己酸生产能力最佳的一株己酸菌的发酵性能进行研究,为进一步的生产应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

老窖泥(1#、2#、3#):某老酒厂优质大曲酒发酵池。

1.1.2 培养基

乙醇醋酸钠培养基[19]:乙酸钠0.5%,磷酸氢二钾0.04%,硫酸镁0.02%,硫酸铵0.05%,酵母膏0.1%,调节pH至7.0,121 ℃高压蒸气灭菌20 min,接种前加入无水乙醇2%。

平板筛选培养基[11]:乙酸钠0.5%,磷酸氢二钾0.04%,硫酸镁0.02%,硫酸铵0.05%,酵母膏0.1%,调节pH至7.0,121 ℃高压蒸气灭菌20 min,接种前加入碳酸钙0.5%,无水乙醇2%以及0.1%溴百里酚蓝指示剂1%。

1.1.3 试剂

细菌基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取试剂盒:天根生化科技(北京)有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-ZFD双人单面洁净工作台:苏州苏洁净化设备有限公司;MJX-250C立式恒温培养箱:上海博迅实业有限公司医疗设备有限公司;LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌锅:上海申安医疗器械厂;ALC-1104电子天平:赛多利斯科学仪器有限公司;Agilent6820气相色谱(gaschromatography,GC)仪:美国安捷伦公司;DHG-9071A电热恒温干燥箱:上海精宏实验设备有限公司;722E可见分光光度计:上海光谱仪器有限公司;LEICA电子显微镜:德国LEICA公司;DK-98-II双列八孔电热恒温水浴锅:天津市泰斯特有限公司;C1000 Touch聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪:美国伯乐公司。

1.3 实验方法

1.3.1 富集培养

称取某酒厂优质窖泥10 g于90 mL无菌水中,内含有无菌玻璃珠,振荡,使窖泥分散均匀成悬液。将样品悬液在80 ℃水浴30 min,杀灭营养体及其他杂菌,富集芽孢。吸取热处理后的悬液,以10%(V/V)的接种量加入乙醇醋酸钠培养基中,装液量为200 mL,于37 ℃条件下培养7 d,连续富集4次后分别测定己酸含量。

1.3.2 产己酸菌的分离筛选

选取富集液中己酸含量最高的样品梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6,将稀释后的菌悬液分别涂于平板筛选培养基上,每个梯度做三组平行,用封口膜封口后倒置于37 ℃培养箱中恒温培养3 d,筛选出黄色或黄绿色菌落。采用三区划线法对得到的黄色菌落进行纯化,得到单菌落[11]。

1.3.3 产己酸菌的鉴定

(1)形态观察及己酸生产鉴定

对分离纯化后得到的菌株进行形态观察[13],将菌株接种于乙醇醋酸钠培养基中,于37 ℃条件下培养7 d后,利用气相色谱法测定己酸含量,以鉴别是否属于己酸菌。

(2)分子生物学鉴定

挑取单菌落于乙醇醋酸钠培养基中,37 ℃条件下培养3 d,10 000 r/min高速离心1 min,收集菌体沉淀。采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA,以其为模板,采用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')PCR扩增细菌16SrDNA序列。PCR扩增体系:10×ExTaqbuffer2.0μL,ExTaq酶(5U)0.2 μL,2.5 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)Mix 1.6μL,上下游引物各1 μL,模板0.5 μL,双蒸水(ddH2O)13.7 μL。PCR扩增条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min 30 s,共25个循环;72 ℃再延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至美吉生物公司测序,将测序结果提交至美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)的Genbank数据库中进行同源性比对。

1.3.4 高产己酸菌发酵性能测试

生长曲线:将种子液(制备方法同1.3.1)按10%接种量接种于乙醇醋酸钠培养基中,37 ℃条件下恒温培养,每隔8~10 h取样,采用可见分光光度计测定其OD600nm值,以未接种的培养基为空白样,每个样品重复三次。

发酵时间对菌株产己酸的影响:将种子液按10%接种量接种于乙醇醋酸钠培养基中,37 ℃条件下恒温培养,每隔24 h取5 mL样品,测定己酸含量,每个样品重复三次。

初始pH值对菌株产己酸的影响:调节乙醇醋酸钠培养基的初始pH值为pH 2.0~12.0共11个梯度,将种子液按10%的接种量接种于乙醇醋酸钠培养基中,37 ℃条件下恒温培养7 d,测定己酸含量,每个样品重复三次。

乙醇对菌株产己酸的影响:在乙醇醋酸钠培养基中分别加入0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的无水乙醇,将种子液按10%的接种量接种于乙醇醋酸钠培养基中,37 ℃条件下恒温培养7 d,测定己酸的含量,每个样品重复三次。

发酵温度对菌株产己酸的影响:将种子液按10%的接种量接种于乙醇醋酸钠培养基中,分别在11~57 ℃(梯度为2 ℃)条件下培养7 d,测定己酸的含量,每个样品重复三次。

1.3.5 己酸的测定

采用GC法测定己酸含量[20]。色谱柱为FFAP白酒分析专用色谱柱(50 m×0.25 mm×0.5 μm);程序升温:初始温度47 ℃,保持5 min,以4.5 ℃/min的速率升温至70 ℃,再以5 ℃/min的速率升温至98 ℃,维持1 min,以5 ℃/min的速率升温至145 ℃,以5 ℃/min的速率升温至190 ℃,以10 ℃/min的速率升温至230 ℃,保持15 min;汽化室温度250 ℃;检测器温度250 ℃;载气为高纯氮气(N2),流速:3 mL/min;进样量0.6 μL;分流比为1∶1。

2 结果与分析

2.1 老窖泥的富集培养

将老窖泥1#、2#、3#分别连续富集4次后,测定己酸含量,结果见图1。

图1 1#(A)、2#(B)及3#(C)老窖泥富集液中己酸含量Fig.1 Caproic acid content in enriched aged pit mud 1#(A)、2#(B) and 3#(C)

由图1可知,在相同培养基成分及培养条件下,3#老窖泥的己酸含量远高于1#老窖泥和2#老窖泥,且随着富集次数的增加,己酸含量增加,产己酸的稳定性好,产酸能力强,故选择3#老窖泥富集液作为筛选优质高产己酸菌的菌源。

2.2 产己酸菌的筛选

通过平板筛选培养基筛选出3株产己酸细菌,编号为A-1、A-3、A-5,其形态观察结果见图2,具体描述见表1及表2。

由图2、表1及表2可知,菌株A-1、A-3及A-5符合己酸菌的基本形态[5],菌落呈白色圆形扁平状,表面湿润光滑,边缘较规则,细胞形态呈杆状,芽孢端生或近端生。

图2 菌株A-1、A-3及A-5菌落形态(A、B、C)及细胞形态(D、E、F)Fig.2 Colony (A,B,C) and Cell (D,E,F) morphology of A-1,A-3 and A-5

表1 菌株的菌落形态Table 1 Colony morphology of strains

表2 菌株的细胞形态Table 2 Cell morphology of strains

2.3 筛选菌株的己酸生产鉴定

菌株A-1、A-3、A-5的己酸产量见图3。由图3可知,菌株A-1、A-3、A-5均能产己酸,且产量较高,分别为5.73 g/L、9.77 g/L、7.45 g/L,将其作为高产己酸菌进行进一步研究。

图3 菌株A-1、A-2及A-3的己酸产量Fig.3 Caproic acid yield of strains A-1,A-2 and A-3

2.4 高产己酸菌的分子生物学鉴定

2.4.1 PCR扩增结果

菌株A-1、A-3及A-5的16S rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果见图4。由图4可知,菌株A-1、A-3及A-5的16S rDNA的PCR扩增产物碱基长度约为1 600 bp,与预期结果相符,送至美吉生物公司测序。

图4 菌株A-1、A-2及A-3 16S rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig.4 Agarose gel electrophoresis result of PCR products of 16S rDNA of strains A-1,A-2 and A-3

2.4.2 同源性比对结果

将菌株A-1、A-3、A-5的测序结果在Genbank数据库中进行Blast比对分析,结果见表3。

表3 序列同源性比对结果Table 3 Results of sequence homologous alignment

由表3可知,3株菌株与克鲁维氏梭菌的同源性>98%,表明3株菌均为克鲁维氏梭菌(Clostridium kluyveri),根据己酸生产性能,选取己酸生产能力最高的菌株A-3进行发酵性能测试。

2.5 菌株A-3发酵性能测试结果

2.5.1 生长曲线

图5 菌株A-3的生长曲线Fig.5 Growth curve of strain A-3

菌株A-3的生长曲线见图5。由图5可知,菌株A-3的延迟期为0~22 h,对数生长期为22~80 h,80 h后进入稳定期。

2.5.2 发酵时间对菌株A-3产己酸的影响

发酵时间对菌株A-3产己酸的影响见图6。由图6可知,发酵过程中,菌株A-3的己酸产量呈先升高后趋于稳定的趋势。发酵1~2 d时,己酸含量无明显变化;发酵3~7 d,己酸含量明显升高,己酸含量从1.44 g/L增加至6.10 g/L;发酵8~14 d,己酸含量从6.10 g/L增加至6.71 g/L,变化较小;发酵14 d后,己酸产量趋于稳定,终止发酵。

图6 发酵时间对菌株A-3产己酸的影响Fig.6 Effect of fermentation on caproic acid production by strain A-3

2.5.3 初始pH值对菌株A-3产己酸的影响

初始pH值对菌株A-3产己酸的影响见图7。由图7可知,随着培养基初始pH值的升高,菌株A-3的己酸含量呈先升高后下降的趋势。当初始pH值为7.0时,己酸含量最高,为7.79 g/L,故菌株A-3产己酸的最适pH值为7.0,pH耐受范围为3.0~11.0。

图7 初始pH值对菌株A-3产己酸的影响Fig.7 Effect of initial pH on caproic acid production by strain A-3

2.5.4 乙醇对菌株A-3产己酸的影响

乙醇对菌株A-3产己酸的影响见图8。由图8可知,随着乙醇含量的增大,菌株A-3的己酸含量呈先升高后下降的趋势。当培养基中乙醇含量为2%时,己酸含量最高,为6.22 g/L。不添加乙醇时,菌株A-3不产己酸,表明乙醇是产己酸的必要条件之一。乙醇含量过高,对己酸菌有一定的抑制作用,其己酸含量显著下降(P<0.05)。当乙醇含量为6%时,发酵液中几乎检测不出己酸。故菌株A-3的最适乙醇含量为2%,乙醇最高耐受度为5%。

图8 乙醇对菌株A-3产己酸的影响Fig.8 Effect of ethanol on caproic acid production by strain A-3

2.5.5 发酵温度对菌株A-3产己酸的影响

发酵温度对菌株A-3产己酸的影响见图9。由图9可知,随着发酵温度的升高,菌株A-3的己酸含量呈先升高后下降的趋势。当发酵温度为37 ℃时,己酸含量最高,为8.17 g/L。当发酵温度低于11 ℃或高于57 ℃时,则几乎不产己酸,故最适发酵温度为37 ℃,温度耐受范围为13~55 ℃。

图9 发酵温度对菌株A-3产己酸的影响Fig.9 Effect of fermentation temperature on caproic acid production by strain A-3

3 结论

通过对老窖泥的多次富集培养,从3#老窖泥中筛选得到3株高产己酸的菌株A-1、A-3和A-5,己酸产量分别为5.73 g/L、9.77 g/L、7.45 g/L。通过形态观察及分子生物学技术鉴定3株菌株均为克鲁维氏梭菌(Clostridium kluyveri)。其中Clostridium kluyveriA-3己酸产量最高,对其发酵性能进行测定。结果表明,Clostridium kluyveriA-3在22 h后进入对数期,80 h后进入稳定期,其产己酸的最佳初始pH值为7.0,发酵时间为14 d,发酵温度为37 ℃,乙醇含量为2%,pH耐受范围为3.0~11.0,乙醇最高耐受含量为5%,温度耐受范围为13~55 ℃。通过对高产己酸A-3菌株发酵性能的研究发现,其产酸性能极佳,发酵性能良好,可为进一步的生产应用奠定基础。

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