张媛 余蕾 雷楠 赵馨

摘   要：海水微藻常见种之一的三角褐指藻，在培养观察过程中，针对其细胞形状多变、特定形状细胞的生长周期不清晰等问题，结合传统光学显微镜及血球计数板法，开展了对三角褐指藻单一细胞形状（菱形）的保种、最优接种量的确定及生长周期的观察等的分析及优化。结果显示，实验中运用的单一藻细胞分离、计数、生长等方法操作简单，可为日常生物实验中有关单细胞藻类的培养与观察方法的优化提供数据支撑，具有一定的实践意义。

关键词：单细胞藻类;三角褐指藻;细胞形状;计数;生长周期

硅藻是一类具有重要生态、经济意义的单细胞真核微藻，代表性硅藻物种—三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）作为一种模式硅藻广泛应用于藻类生理、生态方面的研究[1]。据报道，三角褐指藻是一种优质的水产蛋白饵料，富含活性物质如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）、岩藻黄素[2]，是生产EPA的潜在原材料[3-4];是微藻生物柴油的重要原料，具有较高的中性脂三酰基甘油（TAG）[5];对二氧化碳具有极高的耐受性，其光合固碳是生物法处理工厂废烟气的理想途径[6];是应用于生物监测技术的指示生物，可直接用来评价水质的安全状况[7]，是海洋浮游生物毒性测试中常用的实验材料[8];生长速度快，分布较广，仅生活于海洋环境中，在中国沿岸海域均有分布[9]，取样分析方便，有利于收集。因此，在水产养殖、食品添加、水质安全等教学实验工作中，对于材料获取方便、生长周期短、活性产物丰富的单细胞藻类开展相关培养研究，具有非常重要的应用价值。

有关藻生理、生态的科研工作，常常以细胞丰度变化作为研究的关键指标之一，也是最为直接、简单的监测指标，在高校日常教学实验中广泛应用于了解浮游植物的生长状态、生物量测定甚至环境安全质量等，实操手段简单、实用价值高。经典的细胞计数方法是显微镜计数法，虽比较耗时费力但准确度高，且其计数流程简单。然而，开展三角褐指藻生理生态等教学实验方面的工作，需基于简单易操作、重复性高的室内藻类培养及观察。三角褐指藻在形状特征方面具有多态性，总体上有4种主要形状类型：梭形、三出放射状、卵形[10]和十字交叉型，且不同形状间在不同培养条件下可相互转化[11]。同时，三角褐指藻细胞间的黏附强度也与形状类别密切相关[12]，对实验工作的分析造成了较大影响，包括细胞生长、不同生长阶段藻细胞的周期性观察等。本研究以加强教学实用性为目的，以常见海洋微藻三角褐指藻为研究对象，结合传统光学显微镜及常用计数观察法（血球计数板法），开展三角褐指藻单一细胞形状的分离、保种、初始接种量确定及生长周期观察等的实验方法分析，优化其实验教学流程，获得较为简便、快捷、准确、可行的藻细胞培养及其生理特征观察等实验方法。

1    材料与方法

1.1  藻种及其培养条件

三角褐指藻藻种由国家海洋局第三海洋研究所藻种室提供。

三角褐指藻的培养采用f/2海水液体培养基[13]，在三角锥瓶中进行富集培养。使用的海水为0.45 μm滤膜过滤的自然海水（pH 8.0±0.4，盐度27‰～32‰）;加入藻细胞前，量取300 mL培养基装于500 mL三角锥形瓶，经121 ℃高压灭菌处理。培养温度为20 ℃，光照强度为2 000～3 000 lux，光暗周期12 h∶12 h[14]。

1.2  主要仪器设备

主要仪器设备包括三温区光照培养箱KB-200L-3（匡贝）、净化工作台SW-CJ-2D（苏州净化）、光学显微镜 ECLIPSE E200（Nikon）、血球计数板XB-K-25（求精）、高压蒸汽灭菌锅MJ-54A（STIK）、电子天平EX224（OHAUS）等。

1.3  藻类计数方法

显微镜计数法：将藻液用漩涡混匀器充分混匀后，加入 0.5%的戊二醛固定，然后将藻液充分混匀。准确吸取不同质量浓度的藻液细胞0.1 mL，置于血球计数板上，于光学显微镜下进行细胞计数，每个样品计数3次取其平均值[15]。

2    实验结果与讨论

2.1  单一细胞形状三角褐指藻的保种

三角褐指藻具有多种细胞形状，且不同细胞形状间可相互转变，如梭形可变成三出放射状，三出放射状可变成十字交叉型，三出放射状也可变成梭形等[10-11]。在实验室内开展的藻类培养中也出现了该情况，如三角褐指藻经过一定周期（2～4周以上）的培养，会在同一批液体培养基中同时出现菱形、三射型，甚至是四射型等形状不一、比例不同的藻细胞混合液，一般为保持单一的细胞形状，常用的做法是减少培养周期并定期移出少量原液至新鲜培养基中进行重新接种。往往工作量较大，培养基用量也较多，且混入少量其他形狀细胞的概率非常大，易重新造成藻细胞形状不纯，重复后续单一形状藻细胞的分离、纯化工作。虽然可在重新接种前进行光学显微镜观察，排除可能存在的其他形状细胞，但同时也增加了很多工作量，且成功排除率较低，效率不高。针对此，经过一定时间的观察、分析，通过参考96孔板等多孔板进行藻细胞单一形状纯化的方式，本研究将经过2周培养的单一细胞形状的藻细胞（菱形），分批次（20 μL体积）加入到已添加新鲜f/2培养基（80 μL体积）的96孔板中（3组平行，共计96×3=288个样品），并将其置于培养箱中培养。经过10天的光暗周期培养，从96孔板中每个小孔板中取出50 μL藻液，置于玻璃载破片上面进行全部细胞形状的观察，并记录出现除菱形外的其他细胞形状的小孔数量。部分结果如表1所示。

从结果可看出，经过10天的培养，96孔板中仅有少数微孔出现非菱形细胞，且多数为三射型细胞;单一形状的保种成功率为（288-14）/288≈95.14%。应用该方法后又开展了几次类似的实验工作，获得的单一细胞形状的保种成功率为93.75%～100.00%，保种成功率较高。上述实验说明，相对传统方法，采用96孔板进行细胞形状多变的藻单一形状的保种，保种成功率较高，其优点是准确率高且批次数量多、试剂耗材使用量少、易于操作等，可在今后的藻类实验教学中推广。

2.2  三角褐指藻接种量确认

藻细胞生长常有不同的生长阶段（停滞期、指数期、稳定期），为达到这一目的，在藻类培养过程中，需确定最初的藻细胞接种量，过低或过高都会影响后续实验的观察。常用的计数方法是血球计数板法，通过已设置好的藻液体积，可在光学显微镜下较为准确地计算出培养基中的藻细胞浓度，应用广泛。然而，应用血球计数板法进行细胞计数有一定的浓度限制[16]。基于这一情况，本研究设置了起始细胞浓度（大于104个/mL）分在不同的两组（A组和B组）藻细胞样品（每组两个平行分别是A1和A2，B1和B2）中，并计数观察其生长情况。具体实验过程是，取经过一定周期培养的藻细胞原液（约6.5×106个/mL）至含有相同体积（75 mL）的新鲜培养基的A1、A2、B1和B2，其中，A1和A2初始接種量是B1和B2的100倍。通过3天的计数观察，具体结果如表2所示。

从结果可看出，稀释了100倍的B1和B2经过血球计数板法计数后，其结果并不能真实反映藻类实际质量浓度值，且还出现藻细胞空白个数的情况。但A1和A2中藻细胞质量浓度，经计算后为4.0×105个/mL，是原始母液的6.15%，这与母液接入量的比例（1/16）基本相同。观察藻细胞随时间的变化情况，可看出B1和B2的藻细胞在经过4天的光暗周期培养后，基本达到了A1和A2中最初接入的藻细胞质量浓度。这说明，在应用血球计数板法计数三角褐指藻细胞质量浓度时，较好地接入细胞质量浓度应在105个/mL以上，其获得的质量浓度值结果较为准确、可信。

2.3  三角褐指藻一步生长曲线及其观察

在藻类培养过程中，常需要对不同生长阶段的细胞进行各类参数的观察、分析，常用的做法是开展一步生长曲线的实验观察。通过前面藻细胞单一形状的保种、接种量的观察，本研究对三角褐指藻的一步生长曲线情况作了进一步的分析，具体结果如图1所示。

可以看出，初始接种量为4.0×103个/mL的三角褐指藻，在经过14天的室内恒定环境培养其生长可分为3个阶段：停滞期（第1天到第4天）、指数生长期（第5天到第12天）、稳定期（超过第12天）;其细胞密度从第一天的4.0×103个/mL，到第11天的9.8×106个/mL，增长了约2 450倍。生长曲线的制定，有助于在实验教学过程中针对学生在开展藻细胞观察时，为初始接种量的确定、观察时间设置、观察频次设置、不同生长阶段细胞大小观察、形状变化分析以及其他形状如三射型、四射型细胞培养等提供数据支持。

2.4  实验小结

相对传统方法，采用96孔板进行细胞形状多变的藻单一形状的保种，保种成功率较高，其优点是准确率高且批次数量多、试剂耗材使用量少、易于操作等。在日常教学中，为引导学生进行准确的生长周期观察，应用血球计数板法进行三角褐指藻细胞质量浓度计数时，较好地接入细胞质量浓度应在105个/mL以上，其获得的质量浓度值结果较为准确、可信。

3    结语

目前，多数学校（大中专）在生物专业的教学实验课程中，多以微生物（细菌）培养来引导学生认识个体较小、繁殖力强的生物个体及其生理特征，造成了课程体系千篇一律、学生接触面小、兴趣点不足、创新力不强等常见状况。海洋微藻与微生物（细菌）类似，个体小、数量多、易培养、易观察、门类多等，是滨海城市海洋水体中常见的生物种，在海洋环境中具有重要生态和经济价值，在日常教学中有的放矢地制定相关藻类培养实验课程，可进一步拓宽学生知识面，提高其实验积极性，有助于实验技术技能的增强。

海洋微藻作为我国海洋生物资源保护、开发的重点，开展藻类纯化培养实验的教师，也可通过日常教学中对于藻细胞周期等生理生化特征的观察、纯化等，发现具有重要生态、经济价值的藻类物种，响应国家有关高校产学机制的政策，做到产学高效运行“两不误”。本研究中的三角褐指藻，即是一类具有重要生态、经济意义的单细胞真核微藻硅藻的代表性藻种之一，在水产养殖、生物毒害检测、活性物质开发等领域已被广泛报道。与生物专业日常实验教学中常用的微生物（细菌）特征类似，三角褐指藻具有微藻特征优势，可作为一类重要的实验材料。本研究结合传统光学显微镜及血球计数板法，完成了对三角褐指藻单一细胞形状的保种、接种量大小及生长阶段观察等方面的分析及优化，实验结果可为日常生物实验中有关单细胞藻类的培养与观察方法的优化提供数据支撑，具有实践意义。

[参考文献]

[1]贺立燕.三角褐指藻十字交叉形态的形成及其对该藻产脂特性的影响[D].青岛：中国科学院研究生院（海洋研究所），2014，

[2]RAM R F A，ESTEBAN C N L，ROBLES M A，et al.Lipid extraction from the microalga phaeodactylum tricornutum[J].European Journal of Lipid Science and Technology，2010，109（2）：120-126.

[3]赵佩佩.三角褐指藻对不同环境因子的响应机制与途径[D].北京：中国科学院大学，2015.

[4]MEDINA A R，CERD N L E，GIMNEZ A G，et al.Lipase-catalyzed esterification of glycerol and polyunsaturated fatty acids from fish and microalgae oils[J].Progress in Industrial Microbiology，1999，35（99）：379-391.

[5]魏  玮.三角褐指藻三酰基甘油合成相关基因的功能验证[D].汕头：汕头大学，2013.

[6]伍松翠.三角褐指藻对不同浓度CO2的生理响应及其固碳机制[D].青岛：中国科学院研究生院（海洋研究所），2016.

[7]SCHREIBER U，M LLER J F，HAUGG A，et al.New type of dual-channel PAM chlorophyll fluorometer for highly sensitive water toxicity biotests[J].Photosynthesis Research，2002，74（3）：317-330.

[8]牛  晓.苯并[α]芘对三角褐指藻毒性和生理的研究[D].青岛：中国海洋大学，2015.

[9]钱树本.海藻学[M].青岛：中国海洋大学出版社，2014.

[10]DE M A，BARTUAL A，WILLIS A，et al.Physiological and molecular evidence that environmental changes elicit morphological interconversion in the model diatom Phaeodactylum tricornutum[J].Protist，2011，162（3）：462-481.

[11]ANA B， BEATRIZ V，FERNANDO G B..Monitoring the long-term stability of pelagic morphotypes in the model diatom Phaeodactylum tricornutum[J].Diatom Research，2011，26（2）：243-253.

[12]STANLEY M S，CALLOW J A.Whole cell adhesion strength of morphotypes and isolates of Phaeodactylum tricornutum（Bacillariophyceae）[J].European Journal of Phycology，2007，42（2）：191-197.

[13]GUILLARD R R L，RYTHER J H.Studies of marine planktonic diatoms：i.cyclotella nana hustedt，and detonula confervacea（cleve）gran[J].Canadian Journal of Microbiology，1962，8（2）：229-239.

[14]王  麗，应  波，鄂学礼.三角褐指藻培养条件的选择[J].中国卫生检验杂志，2006，16（7）：777-779.

[15]侯建军，黄邦钦，戴相辉.赤潮藻细胞计数方法比较研究[J].中国公共卫生，2004，20（8）：907-908.

[16]赵  苹.血球计数板的解读[J].中小学实验与装备，2011（6）：7-8.

Abstract：Phaeodactylum tricornutum， one of the common species of seawater microalgae， has a variety of cell morphologies and unclear growth cycles of specific shaped cells during inculture. Combined wtih traditional optical microscopy and blood cell counting plate method，the analysis and optimization of the conservation of unicellular algae （diamond）， the determination of the optimal inoculum size， and the observation of the growth cycle were carried out in this study. The results show that isolation and counting of unicellular algae in this study are simple and easy to operate， which can provide data support for the optimization of algae cultivation and observation in daily biological experiments.

Key words：unicellular algae; phaeodactylum tricornutum; cell morphology; cell count; growth cycle