杨波，卢欣，于睿莉，张皓旻，张钧栋，迟小华，叶芳，卢学春*

(1解放军总医院第二医学中心血液科，2解放军总医院国家老年疾病临床医学研究中心，北京 100853；3吉林省磐石市人民医院电诊科，磐石 132300；4首都医科大学附属北京世纪坛医院变态反应科，北京 100038；5火箭军特色医学中心药剂科，北京 100088；6北京市垂杨柳医院血液科，北京 100020)

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)是一种由新型冠状病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)引起的新发传染性疾病，具有传染性强、感染后危重患者进展快，以及容易诱发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的临床特征。人类进入21世纪以来，短短20年已爆发3次冠状病毒疫情，即严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)、中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome,MERS)和本次的COVID-19。自COVID-19爆发以来，中国政府采取了高效的防控措施，各领域学者集智攻关，已对本病有了一定程度的认识。根据一系列临床观察研究报道，尽管目前看来本病总体病死率较SARS、MERS低，但对于重症和危重症患者来讲，短期内病情进展快速，往往累及两个或两个以上的器官损伤，即MODS，从而导致其治疗难度大、病死率高。目前，关于本病的重症和危重症的临床病理机制尚不十分明确，也缺乏针对性的干预治疗方案。本文通过对感染人类的SARS冠状病毒(SARS coronavirus，SARS-CoV)多组学生物信息学分析，探索COVID-19相关MODS的分子机制及潜在干预药物。

1 对象与方法

1.1 研究对象

以“coronavirus”为检索词在基因表达汇编(gene expression omnibus，GEO)公共数据库进行检索，查看所有“series”。具体数据筛选标准如下：(1)物种为人或小鼠；(2)至少3个生物重复；(3)实验设计思路清晰、数据质量好。在详细查看所有数据的注释文件、确定数据集中样本类型及数量后进行分析。本研究使用的冠状病毒基因表达谱数据来自GEO数据库，数据具体信息如下：芯片实验编号59185，物种来源为小鼠，实验设计为SARS冠状病毒野生型/△E/△3/△5/空白对照，5组中每组均为3只，基因芯片平台号为13912。

1.2 方法

1.2.1 数据处理及差异表达分析 在Bioconductor(http://www.bioconductor.org)网站下载生物信息分析的R语言程序包。应用Bioconductor中的Impute程序包对已获取表达谱进行归一化处理，使各个样本的数据归一化。同时应用Bioconductor中的注释包对数据进行注释，将探针对应到基因上，如果多个探针对应一个基因，那么用所有探针表达值的平均值代表这个基因的表达值。最后应用biomaRt软件包，将小鼠基因对应回人类基因组上。最终获得用于后续分析的表达谱。

随后应用Bionconductor中的Limma软件包分别筛选表达谱中各亚型SARS病毒感染小鼠与空白小鼠的差异基因。首先使用P<0.05初步筛选，而后应用Bonferroni算法来校正假发现率(false disco-very rate，FDR)的原始P值，并计算倍数变化(fold change，FC)。本研究中，差异基因的筛选标准是FDR<0.05，|Log2FC|>1。4组数据集的差异结果保存用于后续分析。

1.2.2 富集分析及关键基因的筛选 R语言中的clusterProfiler软件包是生物信息学常用的聚类分析工具[1]。本研究对前述筛选的4组差异基因分别进行聚类，聚类结果以P<0.05为阈值进行初步筛选。随后查阅文献筛选其中免疫相关信号通路，同时提取富集在这些信号通路中的差异基因作为关键基因做进一步分析，最后应用R语言对结果进行可视化展示。

1.2.3 潜在干预药物的筛选 本研究课题组前期基于“系统生物学”和“比较功能基因组学”理论设计了“整合多组学分析”算法，并以此为基础建立了涵盖各类疾病、9 000多种临床常用药物、1 000多种中药以及近10万种化合物人体功能基因组学大数据的临床生物信息学表观精准治疗预测平台(EpiMed)[2]。应用该平台对上述关键基因进行多组学关联分析。首先我们选取结果中负相关结果作为具有治疗作用的药物，随后依据关联系数>|0.1|，P<0.05为阈值作为筛选条件。

2 结 果

2.1 SARS-CoV感染相关肺损伤

发现肺损伤相关信号通路7个，设置P<0.05为阈值进行筛选，哮喘信号通路具有显著意义。其中上调基因8个，包括CD40、IL-10、IL-13、IL-5、MBP、Eotaxin、TNF-α、FcεRI，无下调基因，符合差异表达基因截取阈值。

2.2 SARS-CoV感染相关心脏损伤

发现心脏损伤相关信号通路5个，设置P<0.05为阈值进行筛选，病毒性心肌炎信号通路具有显著意义。其中上调基因7个，包括CD40、perforin、ICAM-1、CD80/86、SGCB、Bid、CASP3，下调基因4个，包括DAF、myosin、caveolin-1、laminin，符合差异表达基因截取阈值。

2.3 SARS-CoV感染相关肾脏损伤

发现肾脏损伤相关信号通路3个，设置P<0.05为阈值进行筛选，近端小管碳酸氢盐回收信号通路具有显著意义。其中下调基因2个，为ATPase、AQP1，无上调基因，符合差异表达基因截取阈值。

2.4 SARS-CoV感染相关肝脏损伤

发现肝脏损伤相关信号通路4个，设置P<0.05为阈值进行筛选，非酒精性脂肪肝病信号通路具有显著意义。其中上调基因12个，包括IL-1、IL-6、TNF-α、FasL、Fas、CASP3、Bid、Bax、Bim、CHOP、ATF4、SOCS3，下调基因10个，包括AMPK、PI3K、CxI、CxIV、ACDC、IL-6R、ChREBP、IRS-1/2、C/EBPα、CYP2E1，符合差异表达基因截取阈值。

2.5 SARS-CoV感染相关造血功能损伤

发现造血功能损伤相关信号通路3个，设置P<0.05为阈值进行筛选，造血细胞谱系信号通路具有显著意义。其中上调基因13个，包括CD127、IL-5、TNF、CD64、CD14、CD61、G-SCF、IL-6、IL-11、IL-1、CD49、CD121、M-SCF，下调基因11个，包括SCF、CD117、CD126、CD55、CD10、CD19、CD20、CD21、CD23、CD36、EPOR，符合差异表达基因截取阈值。

2.6 SARS-CoV感染相关MODS的潜在干预药物

通过EpiMed平台进行关联分析，筛选出的对SARS相关MODS具有潜在干预作用的药物及其关联靶分子详见表1。

3 讨 论

基于国际病毒分类系统关于病毒种类划分的规定，新发现的冠状病毒在保守结构域中与已发现的病毒有90%以上的同源性，则认为新发现的病毒属于该物种，这是“种”作为病毒分类系统中最小分类阶元的划分标准。2019-nCoV与SARS病毒的7个基因片段的同源性高于90%，据此判定，这两种病毒属于同一个“种”。自2019-nCoV感染人类爆发以来，中国武汉市是主要疫区，占中国(含港澳台)COVID-19病例总数超过60%，并在其他国家相继发生，为此，世界卫生组织于2020年1月31宣布，COVID-19为国际公共卫生紧急事件。随着中国政府采取了强有力的措施，截至目前，此病传染得到很大程度控制。现已初步认识到，2019-nCoV与SARS-CoV都是通过其表面的刺突蛋白(spike protein，简称S蛋白)与人类细胞表面的受体，即血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)，相互识别而诱导病毒进入细胞致病。最近研究显示，在COVID-19患者的上下呼吸道、血液、尿液、粪便中均可分离出2019-nCoV，这在重症患者尤为明显。这一方面提示病毒从肺部进入人体后复制形成完整病毒颗粒并向全身多个器官播散，另一方面也提示可能具有除呼吸道以外的其他传播途径。利用GeneCards数据库查找，ACE2的mRNA能够在血液、淋巴结、心脏、动脉、骨骼肌、小肠、结肠、脂肪细胞、肾脏、肝脏、肺、多种内分泌腺体、皮肤和生殖器官等检测出，其编码蛋白在心脏、胎儿心脏、胎儿肠道、肾脏、胰腺、胰液、胆囊、尿道、胎盘、卵巢和睾丸中的表达量尤为显著。这更进一步提示，人体内多个组织器官可能是2019-nCoV的靶点。有理由推测，COVID-19是一种可以累及全身多个系统的传染性疾病。老年人由于存在自然的免疫衰老及合并疾病多，导致对病毒的清除能力差和脏器功能贮备下降，预期发生MODS的机率也就比其他人群要高。这与临床所见相一致，即MODS多发生在2019-nCoV感染的老年人。鉴于SARS-CoV和2019-nCoV在基因组类型、感染人体机制及临床病理特征上具有高度相似性，因此，通过对SARS相关MODS分子机制及干预药物的生物信息学分析及预测，对于深入探索COVID-19相关MODS的病理机制及潜在治疗手段具有很好的指导和借鉴作用。尤其是在当前尚未获得2019-nCoV感染人或实验动物的基因组学数据的情况下，这项工作显得尤为重要。本研究采用SARS-CoV感染后发生MODS的小鼠为研究对象，系统分析了感染小鼠的全基因组表达谱芯片，着重分析了肺、心脏、肾脏、肝脏及造血5个器官的组学变化特征，筛选出了各器官损伤的差异信号通路，包括哮喘信号通路、病毒性心肌炎信号通路、近端小管碳酸氢盐回收信号通路、非酒精性脂肪肝病信号通路和造血细胞谱系信号通路。哮喘信号通路中上调的基因包括CD40、IL-10、IL-13、MBP、Eotaxin、TNF-α等；病毒性心肌炎信号通路中上调的基因包括CD40、perforin、ICAM-1、CD80/86、CASP3，下调的基因包括DAF、myosin、caveolin-1、laminin；近端小管碳酸氢盐回收信号通路中仅有2个下调基因，即ATPase和AQP1；非酒精性脂肪肝病信号通路中上调的基因包括IL-1、IL-6、TNF-α、FasL、Fas、CASP3等，下调的基因包括AMPK、PI3K、CxI、CxIV等；造血细胞谱系信号通路中上调的基因包括CD127、CD5、TNF、CD64、CD14、CD61、G-SCF、IL-6、IL-11、IL-1等，下调的基因包括SCF、CD117、CD126、CD55等。从上述差异信号通路及影响的基因来看，SARS-CoV感染后发生MODS可能涉及到炎症促发、白细胞及其组分迁移、血管黏附性增高、凋亡和坏死增加、器官特异性蛋白组分降解、单核/巨噬细胞释放、巨核细胞活化、造血干细胞生长受抑、红细胞膜不稳定等病理生理过程。EpiMed平台筛选出了具有潜在干预作用的药物，包括肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)抑制剂、虎杖、利托那韦、鱼腥草、奈韦拉平、败酱、泛昔洛韦、西多福韦、连翘、α干扰素、磷酸氯喹、瑞德西韦和阿比朵尔。

表1 EpiMed预测出的对SARS相关MODS具有潜在干预作用的药物及关联靶分子

SARS: severe acute respiratory syndrome; MODS: multiple organ dysfunction syndrome; TNF-α: tumor necrosis factor-alpha.

总之，本研究对深刻理解COVID-19的临床病理特征及诱发的MODS分子机制具有良好的指导意义。EpiMed平台预测的上述潜在治疗药物值得在COVID-19进行深入探索和临床试验。