北京株水痘疫苗冻干保护剂的研究

2020-03-25姜雪鸥安娜马娜刘妍妍曲鸽李晴

中国卫生标准管理 2020年3期

姜雪鸥安娜马娜刘妍妍曲鸽李晴

近年来，在疫苗产业中，冻干保护剂里仍然存在着明胶的使用。明胶为大分子蛋白质，源于动物组织，也是细菌内毒素的主要来源[1]，会直接引起接种人员产生不良反应，WHO已经建议避免明胶在水痘疫苗中的使用。本研究采用我国自行分离的水痘-带状疱疹病毒疫苗株北京株（VZV84-7），用其生产的水痘疫苗具有较好的安全性和免疫原性[2-3]，北京株水痘活疫苗接种后其保护率达96.4%。通过优化保护剂，提高水痘疫苗在疫苗生产中的稳定性[4-5]。由于水痘带状疱疹病毒北京株（VZV84-7）比较脆弱，不能在污染物中或者结痂皮中长期存活，它对环境十分的敏感，在高于60℃的环境中会迅速被灭活，且该病毒的感染性仅在6.2≤pH≤7.8的范围，由此可见，其范围很窄[6]。所以为了提高北京株（VZV84-7）水痘疫苗的长期贮存能力，其保护剂需用冻干保护剂。

1 材料

（1）蔗糖：北化20120331；

（2）乳糖：SRS EXP：20131127；

（3）右旋糖酐：SIGMA lot#BCBF2323V Mr15000-25000 131220；

（4）L-精氨酸：上海康达；

（5）明胶：国药沪试；

（6）尿素：北化20120117；

（7）人血白蛋白：成都蓉生；

（8）盐酸：北化；

（9）甘露醇：SRS EXP：20130913；

（10）199培养基：上海康达20121201；

（11）谷氨酸钠：上海协和20120505；

（12）L-谷氨酰胺：20121201。

2 操作过程

本次北京株（VZV84-7）冻干保护剂的对比试验共分为2组，第一组为对照组，即含有明胶（常规生产用的冻干保护剂）的北京株水痘疫苗，共制备一批次；第二组为试验组，即不含明胶的北京株水痘疫苗，共制备9批次。10个批次的北京株水痘疫苗的生产工艺和所用的液体均相同，属于同一批次配备，试验组的9批按照正交试验法制备，见表1。

首先生产组从细胞组接过合格的细胞，2BS细胞的工作代27代连续传代至37代，用40层细胞工厂传代，细胞需长成致密单层，北京株水痘-带状疱疹病毒VZV84-7株，按照0.001～0.05 MOI加入到病毒培养液中，按照200 mL/层的病毒培养液通过灭菌后的分装管道分装至40层的细胞工厂中，于35℃培养，培养2～3天后，当细胞病变达到7%～10%，弃去旧的病毒培养液，用PBS液洗涤细胞工厂的细胞表面2次，洗后加入病毒维持液，于35℃培养24小时，当细胞病变达到70%以上时，弃去旧的病毒维持液，用PBS溶液清洗细胞工厂的细胞表面1次，然后加入EDTA溶液进行消化，待细胞表面出现毛玻璃状态时，用PBS溶液收集病变的细胞，把收集的病变细胞于2～8℃，1 500 r/min的条件下，离心15 min，弃上清液[7]，用10种疫苗冻干保护剂（A-I及含明胶配方），分别收集细胞沉淀复溶，于-60℃以下保存，待检定合格后取出冻融，经过超声破碎，过滤，合并为半成品，然后对半成品进行滴定，送至分包装室进行无菌灌装，用合适的水痘疫苗冻干曲线进行冻干，制备北京株VZV84-7水痘减毒活疫苗[7-8]，冻干后，从每批次的水痘疫苗的成品中随机抽取3支混合后进行成品的滴定、热稳定、下降值（37℃放置一周后）的滴度、水分、外观等的检查。

表1 试验组正交试验的制备方法

表2 10个批次的水痘疫苗检定结果

3 结果

以下为使用上述方法连续制备的10个批次的水痘疫苗的检定结果，见表2。

其他检定指标（pH值、渗透压、溶解时间）均符合要求。

4 讨论

由本次的试验结果可以看出，选用A、B、C、D、E、含明胶冻干保护剂的北京株水痘疫苗的冻干前滴度均大于4.0，而冻干后的滴度只有D和含明胶的冻干保护剂的滴度是大于4.0，且它们的水分以及外观等检查项目都符合标准。

对于大多数的减毒活类疫苗的产品，冻干是提高疫苗稳定性的重要手段，为了提高冻干疫苗的稳定性，生物制品中加入保护剂是常用的方法，使用保护剂能够更好地改变水痘疫苗在冻干过程中受环境等因素所造成的的损伤，可以更好地保持住生物样品原有的生物活性以及结构，同时也能够提升生物制品储藏期内蛋白的稳定性。

根据本次实验结果分析出，在水痘疫苗的制备当中，明胶充当赋形剂的作用，但它的过敏性及不良反应，导致其在以后的疫苗保护剂中终将会被替代，而此次试验中的右旋糖酐、甘露醇、蔗糖、乳糖的新型配方表现出可取代明胶的地位，并且由于明胶在对并北京株（VZV84-7）病毒的保护作用很小，所以可忽略其对疫苗病毒的保护作用[9-11]。如果新型的冻干保护剂应用在北京株水痘疫苗的生产工艺中，将会使水痘疫苗的安全性方面得到大幅度的提高，因此，取消明胶在水痘疫苗中的应用，对日益发展的生物制品行业是价值的。