张永德　冯鹏霏　余艳玲　潘传燕　宋漫玲　肖蕊　罗洪林

摘要：【目的】明確卵形鲳鲹胚胎发育中肌细胞生成素基因（MyoG）的表达规律，为阐明MyoG在卵形鲳鲹胚胎生长发育中的作用机制打下基础。【方法】采用RT-PCR扩增卵形鲳鲹MyoG基因全长序列，通过ProtParam、GOR IV、SWISS-MODEL、TMHMM、SignalP、PSORT及NetNGlyc 1.0等在线软件对其进行生物信息学分析;运用实时荧光定量PCR检测MyoG基因在卵形鲳鲹不同胚胎发育时期（受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、胚胎形成期、眼囊期、耳囊期、心脏跳动期、晶体出现期和孵化期）的表达情况。【结果】从卵形鲳鲹胚胎组织中克隆获得的MyoG基因全长为1379 bp，编码233个氨基酸残基，其蛋白分子量为26059.19 Da，理论等电点（pI）为8.72;不稳定指数为75.23，即MyoG蛋白稳定性较差;总平均疏水指数（GRAVY）为-0.764，属于亲水性蛋白。卵形鲳鲹MyoG蛋白无跨膜结构，无信号肽序列，在第49位氨基酸处存在1个潜在的糖基化位点;卵形鲳鲹MyoG蛋白主要存在于细胞质和微体中，不属于分泌蛋白，其二级结构中以无规则卷曲占比最高（59.23%），其次为α-螺旋（21.46%）和延伸链（19.31%）。MyoG基因相对表达量在卵形鲳鲹胚胎发育过程中呈明显的先升高后降低变化趋势。其中，在胚胎发育的前期（受精卵至胚体形成期）MyoG基因相对表达量极低，但从眼囊期开始其相对表达量迅速升高，至心脏跳动期达最高值;眼囊期、耳囊期和心脏跳动期3个时期的MyoG基因相对表达量均极显著高于胚胎发育前5个时期（P<0.01，下同）;从晶体出现期开始，MyoG基因相对表达量极显著降低。【结论】MyoG基因除了在卵形鲳鲹眼囊期、耳囊期和心脏跳动期的分化形成过程中发挥重要作用外，在卵形鲳鲹胚胎器官分化形成后仍发挥着重要作用。

关键词： 卵形鲳鲹;MyoG基因;胚胎发育;生物信息学;表达分析

中图分类号： S965.331                          文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）12-3090-09

Abstract：【Objective】To investigate the expression pattern of myogenin gene（MyoG） during embryonic development of Trachinotus ovatus， and lay the foundation for elucidating the mechanism of MyoG in the embryonic development of T. ovatus. 【Method】RT-PCR was used to amplify the full-length sequence of the MyoG gene of T. ovatus， and the bioinformatics analysis was carried out with online software such as ProtParam， GOR IV， SWISS-MODEL， TMHMM， SignalP， PSORT and NetNGlyc 1.0 . Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of MyoG mRNA in different embryonic development stages（zygote， cleavage stage， blastula stage， gastrula stage， embryo formed stage， optic vesicle stage， otocyst vesicle stage， heart pulsation stage， formation of eye lens and hatching stage） in T. ovatus. 【Result】The MyoG gene cloned from embryonic tissues of T. ovatus was 1379 bp in length， encoding 233 amino acid residues， its protein molecular weight was 26059.19 Da， theoretical isoelectric point（pI） was 8.72. The instability index was 75.23. Which indicated that MyoG protein was not stable. The total average hydrophobic index（GRAVY） was -0.764， indicating that it belonged to hydrophilic protein. MyoG protein had no transmembrane structure， no signal peptide sequence， and a potential glycosylation site at amino acid 49. The MyoG protein mainly existed in the cytoplasm and the microbody（peroxisome）， not belonging to asecretory protein. In the secondary structure， random coil accounted for the highest proportion（59.23%）， followed by α-helix（21.46%） and extended strand（19.31%）. The relative expression trend of MyoG gene was firstly increased and then decreased during the embryonic development of T. ovatus. Among them， the relative expression level of MyoG gene was extremely low in the early stage of embryonic development（from the zygote to the embryo formed stage）， but the relative expression level of MyoG increased rapidly from the optic vesicle stage， and reached the highest value in the heart pulsation stage. The relative expression of MyoG gene in the three phases of optic vesicle stage， otocyst vesicle stage and heart pulsation stage were extremely significantly higher than that in the first five phases of embryonic development（P<0.01， the same below）. From the phase of formation of eye lens， the relative expression of MyoG gene was extremely significantly reduced. 【Conclusion】The MyoG gene not only plays an important role in the differentiation and formation of the optic vesicle stage， otocyst vesicle stage and heart pulsation stage of the T. ovatus， but also plays an important role after the embryonic organ differentiation of T. ovatus.

Key words： Trachinotus ovatus; MyoG gene;embryonic development; boinformatics analysis; gene expression

Foundation item： Guangxi Innovation Driven Development Project（Guike AA17204080-3，Guike AA18242031-2）; Independent Project of Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture（17-A-01-02，19-A-01-05）

0 引言

【研究意义】卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）又称黄腊鲳、金鲳鱼，为广盐暖水性中上层鱼类，主要生活在大洋洲、美洲及东南亚热带亚热带海域等区域，在我国东南沿海包括福建、广东和广西等地也有一定资源量（张永德等，2020），因其生长速度快、肉质细嫩、无刺、味道鲜美，且营养价值高，在我国南部沿海地区的人工养殖规模得到迅速发展。动物的产肉能力及其肉品质均由具有螺旋—环—螺旋（Basic helix-loop-helix，bHLH）结构的生肌调节因子家族（Myogenic regulator factors，MRFs）调控（Rajesh et al.，2019）。MRFs由4种肌肉特异性蛋白组成，包括生肌决定因子（MyoD）、肌源性调节因子4（Myf4）、肌源性调节因子5（Myf5）和肌细胞生成素（MyoG）（Zammit，2017），在细胞决定及分化过程中发挥重要作用。尽管这些调节因子的长度及氨基酸序列存在一定差异，但均包含3个同源结构域，分别是bHLH结构域、位于N-末端的半胱氨酸/组氨酸结构域及位于C-末端附近且富含丝氨酸/苏氨酸的结构域（Asfour et al.，2018）。在机体的生长发育过程中，MyoD、Myf4和Myf5被视为成肌决定因素，指导干细胞建立骨骼肌谱系;MyoG则与MyoD和Myf4共同激活肌分化程序，其表达贯穿于动物体所有成肌细胞开始分化至细胞融合的生理过程，在肌肉发育中发挥特定作用（Comai and Tajbakhsh，2014）。已有大量研究证实，MyoG基因与猪、牛等哺乳动物的生长速度、产肉率及肉品质等重要经济性状密切相关（Bocian et al.，2002;Xue and Xu，2007;Bhuiyan et al.，2009），因此其功能研究已成为当前动物遗传育种及发育生物学等领域的热点。【前人研究进展】1898年MyoG基因首次被发现，随后发现其与人类的疾病密切相关（Tseng et al.，1999;Knapp et al.，2006）。目前，國内外有关MyoG基因在肌肉形成机理等方面已有较多研究报道。Hasty等（1993）研究表明，MyoG基因敲除小鼠虽然能在胎儿发育过程中存活，但由于成肌细胞不能分化成肌纤维，因此出生后立即死亡。贾径等（2010）研究发现，MyoG基因与鸭心肌组织发育密切相关，对心肌的生长发育起调控作用。刘铮铸等（2012）、李硕（2013）对山羊和牛的MyoG基因启动子序列进行比对分析，结果发现MyoG基因在肌细胞终末分化过程中不可缺少，同时对肌细胞的融合过程起调控作用。张涛等（2015）研究证实，MyoG基因在家禽中的表达集中在胸肌和腿肌，在心脏和卵巢组织中仅有少量表达;MyoG基因在母鸡中的表达较平稳，而在公鸡中的表达变化较大，其中4周龄表达量最高。李莉鑫等（2019）研究表明，MyoG基因在小鼠心肌中的表达量随年龄的增长而呈下调趋势。MyoG基因研究在畜禽及小鼠等物种上已有较多报道，在鱼类生长发育等方面的研究则相对较少。Hinits等（2009）研究发现，MyoG是斑马鱼早期发育快速纤维分化的重要贡献者;宫佳琦等（2012）研究表明，MyoG基因在草鱼的脂肪、红肌、白肌、脑组织、肝胰脏、肾脏、鳃组织、肠道及心脏等组织中均有表达，且以在白肌中的表达量最高，其次是脑组织、肝胰脏和鳃组织。【本研究切入点】近年来，科研人员针对卵形鲳鲹开展了一系列研究，包括生长发育（黄小林等，2018;Liu et al.，2019）、病害及免疫（熊向英等，2018;Sun et al.，2019）、饲料营养（胡海滨等，2019;You et al.，2019）及分子生物学（Wu et al.，2019;Sun et al.，2020）等方面，但有关MyoG基因在卵形鲳鲹胚胎发育过程中的表达模式及作用机理至今尚未明确。【拟解决的关键问题】研究MyoG基因在卵形鲳鲹不同胚胎发育时期中的表达情况，明确胚胎发育中MyoG基因的表达规律，以期为阐明MyoG在卵形鲳鲹胚胎生长发育的作用机制打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

性成熟的健康卵形鲳鲹选自深圳市南澳镇大鹏湾海域人工养殖群体，体重6.2～7.8 kg/尾，经人工催产后，自然交配繁殖。待其自然产卵受精后，置于1000 L的孵化桶中孵化。显微镜下观察确定胚胎所处的发育阶段，并收集从受精卵到仔鱼孵化共10个时期（受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、胚体形成期、眼囊期、耳囊期、心脏跳动期、晶体出现期和孵化期）的样品，每个样品重复取样3次，液氮速冻保存备用。RNAsimple总RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;HiScript? III RT SuperMix反转录试剂盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Mix荧光定量试剂盒及AceTaq? Master Mix均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;ABI 7500Fast qPCR仪购自美国Thermo Fisher公司;梯度PCR仪购自德国Biometra公司。

1. 2 总RNA提取及cDNA合成

从液氮盒取出冻存的组织样品，取适量样品用研磨棒充分磨碎，按RNAsimple总RNA提取试剂盒说明提取卵形鲳鲹不同发育阶段的胚胎组织总RNA。通过2.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整度，采用NanoDrop One微量分光光度计检测RNA浓度。对完整性较好的RNA，根据Hiscript III反转录试剂盒说明进行反转录，以合成cDNA第一链。

1. 3 MyoG基因克隆

根据转录组测序获得的卵形鲳鲹MyoG基因序列，采用Primer 5.0设计特异性扩增引物，引物序列见表1，预期扩增片段大小为1456 bp。以合成的cDNA为模板对卵形鲳鲹MyoG基因进行PCR扩增，扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，进行30个循环;72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物采用2.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，对目的条带进行切胶回收，并送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

1. 4 卵形鲳鲹MyoG基因生物信息学分析

经测序及序列核对后，利用NCBI ORFfinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）进行开放阅读框（ORF）及编码氨基酸预测分析，以ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）预测蛋白基本理化性质;采用GOR IV（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）进行蛋白二级结构预测，运用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）进行三级结构预测，并以SAVES 5.0（http：//services.mbi.ucla.edu/SAVES/）对预测的模型进行评估;跨膜结构采用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行预测;信号肽序列则以SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行预测;蛋白亚细胞定位采用PSORT（http：//psort1.hgc.jp//form.html）进行预测，糖基化位点采用NetNGlyc 1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/#opennewwindow）进行预测。

1. 5 MyoG基因序列同源性分析

采用MEGA X10.0.2将卵形鲳鲹MyoG基因序列与已知其他鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物及人类的30个代表性序列（表2）进行比对分析，计算遗传距离，并构建系统发育进化树;采用Jones-Taylor-Thornton（JTT）模型对空位进行完全删除，并以Bootstrap为1000次检测各分支的置信度。

1. 6 卵形鲳鲹胚胎组织MyoG基因定量检测

以卵形鲳鲹10个发育期胚胎组织的cDNA为模板，对各胚胎发育期的MyoG基因表达情况进行实时荧光定量PCR检测。卵形鲳鲹MyoG基因的实时荧光定量PCR扩增引物（表1）采用Primer 5.0进行设计，以18S RNA为内参基因。反应体系16.00 μL：ChamQ SYBR qPCR Master Mix 8.00 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.32 μL，cDNA模板1.60 μL，DEPC水补足至16.00 μL。卵形鲳鲹MyoG基因相对表达量采用2-??Ct法进行换算，运用SPSS 21.0进行单因素方差分析（One-way ANOVA），并以Duncan?s新复极差法进行组间差异性比较。

2 结果与分析

2. 1 卵形鲳鲹MyoG基因克隆与序测结果

卵形鲳鲹MyoG基因全長1379 bp，包含60 bp的5'端非编码区（5'-UTR）、702 bp的ORF及617 bp的3'端非编码区（3'-UTR），共编码233个氨基酸残基（图1）;其A、C、G、T含量分别为24.87%（343个）、26.76%（369个）、24.51%（338个）和23.86%（329个），且G+C含量（51.27%）高于A+T含量（48.73%），说明该基因序列DNA双链较稳定。卵形鲳鲹MyoG基因推导氨基酸序列包含1个肌源性基本结构域（第1～98位氨基酸）和1个HLH结构域（第99～150位氨基酸）。

2. 2 卵形鲳鲹MyoG蛋白理化性质分析结果

ProtParam预测结果显示，卵形鲳鲹MyoG蛋白分子量为26059.19 Da，理论等电点（pI）为8.72;带负电氨基酸总数（Asp+Glu）为23个，带正电氨基酸总数（Arg+Lys）为28个;不稳定指数为75.23，表明卵形鲳鲹MyoG蛋白稳定性较差;脂溶指数为56.91，总平均疏水指数（GRAVY）为-0.764，说明该蛋白为亲水性蛋白，且亲水性区段主要集中在第8～44位、第59～81位、第88～116位、第119～136位、第156～190位、第191～215位及第217～226位氨基酸（图2）。

2. 3 卵形鲳鲹MyoG蛋白跨膜结构及其信号肽预测结果

通过TMHMM对卵形鲳鲹MyoG蛋白氨基酸序列进行跨膜结构预测，结果如图3所示，MyoG蛋白不存在跨膜螺旋，即无跨膜结构。SignalP预测结果（图4）显示，在卵形鲳鲹MyoG蛋白氨基酸序列中未检测到信号肽，表明该蛋白属于非分泌型蛋白。

2. 4 卵形鲳鲹MyoG蛋白亚细胞定位及糖基化位点预测结果

利用PSORT对卵形鲳鲹MyoG蛋白进行亚细胞定位预测，结果显示，细胞质为0.450，微体（过氧化物酶体）为0.300，线粒体基质空间为0.100，溶酶体（管腔）为0.100，即卵形鲳鲹MyoG蛋白主要存在于细胞质和微体（过氧化物酶体）中，少量分布在线粒体基质和溶酶体内。糖基化位点预测结果显示，卵形鲳鲹MyoG蛋白在第49位氨基酸处存在1个潜在的糖基化位点（图5）。

2. 5 卵形鲳鲹MyoG蛋白空间结构预测结果

利用GOR IV对卵形鲳鲹MyoG蛋白二级结构进行预测，结果发现主要由α-螺旋、延伸链及无规则卷曲构成，其中α-螺旋占21.46%、延伸链占19.31%、无规则卷曲占59.23%。运用SWISS-MODEL进行三级结构预测，结果显示，卵形鲳鲹MyoG蛋白三级结构主要由2个α-螺旋及中间连接的环状无规则卷曲构成（图6）。利用SAVES 5.0对建立的三级结构模型进行评估，结果显示PROCHECK生理化学参数检测有5个通过、3个警告、0个错误。Errat蛋白三级结构评分为100，说明卵形鲳鲹MyoG蛋白三级结构预测结果良好。

2. 6 卵形鲳鲹MyoG氨基酸序列同源性分析结果

以卵形鲳鲹MyoG氨基酸序列与GenBank已公布的其他30个物种MyoG氨基酸序列进行比对分析，并构建系统发育进化树，结果（图7）显示，31个物种聚为两大分支，其中鱼类聚为一支，两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物和人类则聚为另一支。在所分析的鱼类中，卵形鲳鲹、布氏鲳鲹、黄尾鰤和高体鰤同属于鲹形系（Carangaria），遗传距离较近，其中又以卵形鲳鲹与布氏鲳鲹的MyoG氨基酸序列相似性最高，即亲缘关系更近。与真鲈形系（Eupercaria）、远洋鱼系（Pelagiaria）鱼类相比，鲹形系与卵附系（Ovalentaria）具有更近的亲缘关系，其遗传距离更小。此外，爬行动物与鸟类的MyoG氨基酸序列遗传距离较近，而哺乳动物与人类的MyoG氨基酸序列遗传距离更近。

2. 7 MyoG基因在卵形鲳鲹不同胚胎发育时期的表达情况

采用实时荧光定量PCR检测MyoG基因在卵形鲳鲹不同胚胎发育时期的表达情况，结果发现MyoG基因相对表达量在卵形鲳鲹胚胎发育过程中呈明显的先升高后降低变化趋势（图8）。在胚胎发育前期（受精卵至胚体形成期），MyoG基因的相对表达量极低，但从眼囊期开始其相对表达量迅速升高，至心脏跳动期达最高值;眼囊期、耳囊期和心脏跳动期3个时期的MyoG基因相对表达量均极显著高于胚胎发育前5个时期（P<0.01，下同）;从晶体出现期开始，MyoG基因相对表达量极显著降低，晶体出现期和孵化期MyoG基因仍有表达，但与受精期相比差异不显著（P>0.05）。

3 讨论

卵形鲳鲹肌肉高蛋白、低脂肪、消化率高、味道鲜美，食用价值和营养价值均较高，具有巨大的开发前景。卵形鲳鲹的肌肉率约占68%（农新闻等，2008），其中骨骼肌所占比例最高。MyoG基因作为肌生成过程中的关键基因，在胚胎的发生过程中指导肌肉分化，因此，开展MyoG基因研究对揭示卵形鲳鲹生长及肉质形成的分子机理具有重要意义，可为改善卵形鲳鲹的生长速度和肉质提供参考依据。肌肉是由单核成肌细胞融合形成的多核合胞体，对鱼类的生长发育至关重要，肌细胞的分化与增殖、肌纤维的形成及出生后肌肉的成熟和功能完善等均受MRFs调控（刘宁等，2015）。在肌肉的发育过程中，Myf5和MyoD将细胞提交至成肌程序。当细胞进入终末分化时，Myf4和MyoG共表达（Bentzinger et al.，2012），促使动物肌肉细胞形成及分化过程向正向调控发展。脊椎动物肌肉组织中的肌纤维在胚胎期已形成，出生后其数目不再改变。Yun和Wold（1996）研究表明，MyoG基因的表达量及表达时间决定了机体肌纤维数量，在敲除MyoG基因的小鼠中发现有肌细胞存在但无法检测到肌纤维，致使骨骼肌发育严重缺陷而导致小鼠死亡。此外，MyoG是胚胎骨骼肌发育及机体出生后达正常体型所必需的调节因子（Meadows et al.，2011）。在水产方面， MyoG对鱼类肌肉发育的影响与哺乳动物相似，且MyoG基因的表达受光照条件影响（Churova et al.，2020）。在斑馬鱼、黄条鰤和条纹鲈的胚胎中发现MyoG基因特异性表达（Tan et al.，2002;Du et al.，2003），而在兰州鲇肌肉组织中MyoG基因呈显著高表达（俞兆曦，2016）。本研究结果表明，卵形鲳鲹MyoG基因ORF长度为702 bp，共编码233个氨基酸残基，其蛋白分子量为26059.19 Da，理论等电点（pI）为8.72，属于碱性蛋白，但稳定性较差;卵形鲳鲹MyoG蛋白主要存在于细胞质和微体中，无跨膜结构，也不存在信号肽序列，即卵形鲳鲹MyoG蛋白属于非分泌型的胞内蛋白。卵形鲳鲹MyoG氨基酸序列同源性分析结果表明，在鲹形系的4种鱼类中，卵形鲳鲹与布氏鲳鲹的MyoG氨基酸序列遗传距离最近，与黄尾鰤和高体鰤的遗传距离相对较远，与这些物种的系统分类学一致。

肌肉形成是一个复杂的生理过程，在胚胎期由中胚层细胞诱导分化成肌细胞，随后增殖、融合成肌管，肌管再融合成肌纤维。因此，胚胎期中胚层细胞的分化对肌肉形成极其重要。MyoG作为骨骼肌发育的正调控因子，在MRFs家族中占据中心地位，可通过调控自身的表达或与MRFs家族其他成员协同作用，而调节成肌细胞进入多核肌肉细胞，在肌细胞分化过程中发挥关键作用（Mastroyiannopoulos et al.，2012）。为了解MyoG基因在卵形鲳鲹胚胎发育过程中的表达变化规律，本研究采用实时荧光定量PCR检测卵形鲳鲹各胚胎发育时期的组织样品，结果发现，在受精卵到胚体形成期MyoG基因的相对表达量极低，但至胚体期（眼囊期、耳囊期和心脏跳动期）MyoG基因相对表达量明显升高，与受精卵期相比，眼囊期、耳囊期和心脏跳动期3个时期的MyoG基因相对表达量极显著升高，推测MyoG在眼囊、耳囊及心脏等器官肌肉的发育及形成过程中发挥重要作用。随后，MyoG基因在晶体出现期其相对表达量开始下降，直到孵化期均维持在较低水平，但仍高于受精卵到胚胎形成期，可能是MyoG在维持器官肌肉的形态及后续发育中仍发挥着重要作用。综上所述，MyoG基因在卵形鲳鲹重要器官的形成过程中发挥调控作用，但具体作用机制有待进一步探究。

4 结论

MyoG基因除了在卵形鲳鲹眼囊期、耳囊期和心脏跳动期的分化形成过程中发挥重要作用外，在卵形鲳鲹胚胎器官分化形成后仍发挥着重要作用。

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（責任编辑 兰宗宝）