宋宇康 ，邢志伟 ，周国平 ，张平 ，张李阳

（南京晓庄学院，江苏 南京 211171；2.南京龙鲫水产开发有限公司，江苏 南京 211500；3.南京市水产科学研究所，江苏 南京 210036）

龙池鲫鱼因产于江苏省南京市六合区城南龙池而得名，其味道鲜美，出肉率高，深受当地市民青睐。近年来，龙池鲫鱼混杂严重，加之过度捕捞，寻常百姓已难觅其踪迹。该试验通过流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）来测定龙池中鲫鱼的DNA含量来分析其倍性特征，使原有龙池中混杂的龙池鲫鱼纯化出来，并开展龙池鲫鱼亲本培育、苗种繁育以及成鱼养殖，使龙池鲫鱼实现产业化推广并且加强其资源增殖，也为以后对龙池鲫鱼的研究提供参考。

流式细胞术（FCM）是利用荧光染料、激光技术、单抗技术和计算机技术定量测定细胞DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性等许多重要参数，是一种准确鉴定鱼类倍性的理想方法。同时，该试验采取的T型标技术为体内标记法，为最早使用的方法之一，此法简便又快，适用于各种鱼类。加之对侧线鳞数量的辨别也可作为区分二倍及三倍体鱼的依据。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼

试验用鱼于2017年11月—2018年1月，从六合龙池闸段采捕1 000尾鲫鱼，暂养于南京龙鲫水产开发有限公司养殖基地，暂养池为50 m×300 m，水深1.5 m。试验前拉网放置于2 m×2 m×2 m的网箱内待测。鸡红细胞为国际上的公认标准，其DNA含量按2.50 pg/N来计算。

1.2 T型标标记法

T型标记标记是用物理的方法，将带有数字、文字、字母等信息的标签注入到动物体表，肉眼可辨，方便识别，能在短时间内标记大量的个体动物，广泛应用于鱼类、甲壳类和贝类物种。该试验首先将其侧线鳞进行计数。在标记时，先用75%酒精将枪头消毒后再使用。标记时应选择被标记鱼背鳍基部下方背部肌肉最厚的部位，所使用的枪头不能穿透鱼体，用手指轻按压被标记的部位迅速抽出标记枪，标记结束后务必对所标记部位用酒精消毒，为避免伤口感染以及疾病的传播。

1.3 样品的制备

完成挂牌标志后，将1 mL一次性注射器先用75%的酒精将针头消毒，从龙池鲫鱼的尾静脉取血0.3～0.5 mL，注射在5 mL的紫色抗凝管中防止鱼血凝固，然后再注入4 mL离心管中在1 000 r/min离心3 min，去除上清液。将处理好的鱼血放在4℃冰盒保存送至实验室待测。鸡血取自于翅膀静脉，处理方法同上。

1.4 样品染色

该试验测定DNA所用的试剂为瑞景特生物有限公司的PI试剂盒，该试剂分为A液和B液两种对DNA进行染色测定。首先将固定的红细胞混匀，在4℃、1 200 r/min下用预冷的PBS洗细胞2次，加入预冷的70%乙醇，于4℃固定30 min，再用300 g离心5分钟收集细胞，去除上清液，再重悬于400μL PBS中。最后制备PI综合液，取500μL A液和2μL B液混合均匀，在每份细胞悬液中加入100μL PI综合液，避光孵育30分钟。然后再用300目尼龙网过滤后，上机检测。

1.5 DNA含量测定

采用美国贝克曼库尔特的FC500流式细胞仪，激发光源为20 mW氩离子激光器，激发波长488 nm，分别进行单参数检测。使用机器前需要用标准微球调整仪器，要求CV＜5%，检测前先做贝克曼公司质控，质控不合格则不可以检测。以鸡血细胞作为标准，每个样品采集的细胞总数为104个。使用CXP软件收集数据（每秒收集100～300个细胞），Modfit2.0软件进行DNA细胞周期及倍性分析。

1.6 数据和图形分析

测量的数据和图均为计算机软件分析所得，然后将对照样品和待测样品的处理资料按照统计学进行计算机分析。

样品鱼的DNA绝对含量按下列公式计算：

式中：P1为检测鱼红细胞的DNA绝对含量（pg/N），P2为标准鸡红细胞DNA绝对含量（2.5 pg/N）；E1为鸡红细胞的相对DNA含量，E2为检测鱼红细胞的相对DNA含量。

2 结果

2.1 龙池鲫鱼红细胞DNA检测直方图

该试验采用鸡血红细胞做为参考标准，用流式细胞仪测定了1 000尾龙池鲫鱼红细胞的相对DNA含量。图1为鸡血红细胞，图2为雌性龙池鲫二倍体的流式细胞仪检测直方图的代表性结果，图3为雄性龙池鲫二倍体的流式细胞仪检测直方图的代表性结果。

图1 鸡血的流式细胞仪检测直方图

直方图中纵坐标表示检测的细胞核数，横坐标表示样品细胞的平均荧光强度值，即样品细胞的DNA相对含量。图1中主要出现一个峰为G0/G1期峰，其图像清洗干净，前后无杂峰出现，说明其DNA的相对含量最低，细胞频率最高，是细胞周期中的G0/G1期细胞；其峰形尖锐，CV＜5%，说明对样品处理和检测方法较好，其峰值代表DNA含量相同的G0/G1期细胞。从图1可以看出鸡红细胞的相对DNA含量接近190，从图2和3中可以看出二倍体龙池鲫鱼的DNA相对含量接近290。实验检测的1 000尾龙池鲫鱼中，120尾龙池鲫样品的红细胞核相对DNA含量接近290，占12%；880尾鲫鱼接近330（为三倍体鱼），占群体总数88%。

图2 龙池鲫二倍体的流式细胞仪检测直方图（雌鱼）

2.2 龙池鲫鱼DNA含量与倍性

图3 龙池鲫二倍体的流式细胞仪检测直方图（雄鱼）

测定的龙池鲫鱼的相对DNA含量和鸡血的相对DNA含量结果见表1。从表1中可知，在所测的1 000尾龙池鲫鱼群体当中有120尾的DNA含量为3.82 pg/N，有880尾（为三倍体鱼）的DNA含量为4.34 pg/N。可以看出，该试验所采集的鱼群是由二倍体龙池鲫鱼和三倍体龙池鲫鱼组成的。

2.3 龙池鲫的形态学特征

该研究随机抽取了龙池鲫鱼和三倍体鲫鱼共1 000条对其侧线鳞进行测数，并对其体质量、体厚、体长及体高用卷尺进行测量，将二倍体龙池鲫鱼和三倍体龙池鲫鱼进行比较分析。由表2可以看出，二倍体龙池鲫鱼的侧线鳞数量平均为28，三倍体鲫鱼的侧线鳞数量平均为30，二倍体龙池鲫鱼明显少于三倍体鲫鱼的侧线鳞数量，可见侧线鳞数可以作为区分二倍体龙池鲫鱼和三倍体鲫鱼的重要指标之一。

2.4 龙池鲫鱼T型标效果

被标记过的龙池鲫鱼经过3周圈养，统计其T型标标记后的成活率和脱牌率。经过检测后。龙池鲫鱼的生理活动较往常一样，成活率100%，1 000尾龙池鲫鱼脱标12尾，脱标率为1.2%。

表1 流式细胞仪检测龙池鲫鱼的DNA含量

表2 二倍体与三倍体龙池鲫鱼的形态特征

3 讨论

3.1 龙池鲫鱼红细胞核DNA含量

该研究中三倍体鲫鱼的DNA绝对含量为4.34（pg/N），二倍体龙池鲫鱼的DNA绝对含量为3.82（pg/N）。说明三倍体龙池鲫鱼的DNA绝对含量比二倍体龙池鲫鱼要高。

3.2 龙池鲫鱼群体的倍性

染色体数在290左右的核型分析认为同源染色体一般是两两配对而成的，是属于二倍体。

该研究运用该方法测定的龙池鲫鱼的DNA含量有290和330两种数值。该研究证实了南京六合龙池的野生龙池鲫鱼是由二倍体和三倍体所组成的一个混合的群体，原因可能是最初有三倍体的混入不断的杂交繁殖所形成的，也可能是人工养殖的鲫鱼混入，所造成的。

3.3 龙池鲫鱼研究的意义

通过龙池位于南京市六合区西部，水质肥沃，矿物质丰富，浮游生物很多，生长出的鲫鱼以头小、背宽、体厚，肉嫩、味鲜为主要特点。由此可见，所谓的龙池鲫鱼就是在龙池的特定生态环境中生长的地域性二倍体的野生鲫鱼。流式细胞仪测得的DNA含量，将二倍体和三倍体分开，成功的将龙池鲫鱼提纯,主要目的是对野生龙池鲫鱼的提纯复壮，通过将其二倍体与三倍体分离，从而得到纯种的龙池鲫鱼，通过繁殖培育扩大鱼种，推广龙池鲫鱼，让龙池鲫鱼能够被更多市民所消费，也为后期研究龙池鲫鱼的营养价值提供依据。