梁政委，杜增丰，李超伦，王敏晓，王 冰，张 鑫，阎 军

1. 中国科学院海洋研究所，中国科学院海洋地质与环境重点实验室，中国科学院海洋研究所深海极端环境与生命过程研究中心，山东 青岛 266071 2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋地质过程与环境功能实验室，山东 青岛 266061 3. 中国科学院大学，北京 100049 4. 中国科学院海洋大科学研究中心，山东 青岛 266071

引 言

海洋贻贝属软体动物门，瓣鳃纲，其广泛分布于沿岸和近海，主要通过足丝附着于岩石、船体或其他基质表面来生存。贻贝的足丝通过贻贝足腺体分泌贻贝粘附蛋白(mussel adhesive protein, MAP)而形成的，这些蛋白在贻贝腹沟内经过一系列作用形成组分、结构和功能完全不同的核心、外皮表面和粘附盘[1-2][图1(a)]。

近年来，关于贻贝足以及足丝的研究已经取得一定进展，Filippidi等阐明了足丝组成：足丝核心部分主要由半结晶的胶原蛋白组成，称为Precols；足丝纤维外皮表面由贻贝足蛋白-1(mfp-1)组成，对核心起到保护作用；粘附盘由大量富多巴的蛋白质组成(mfp-2, -3, -4, -5, -6)，主要成分是酪蛋白经过后翻译修饰羟基化而形成的-3,4-二羟基苯丙氨酸(多巴，DOPA)，在贻贝足丝与其他基质表面粘附时起主要作用[2-3]，Inoue等利用分子生物学方法研究了海洋贻贝足丝粘附蛋白的分子结构[4]、Schmitt等的研究工作阐述了贻贝的DOPA与Fe等金属离子进行螯合作用的粘附机理[5]、Priemel等利用拉曼光谱技术对贻贝足腺体以及人工诱导后的腺体进行拉曼光谱检测揭示了贻贝足丝的生成的一系列生物调控过程[6-7]。相比于传统的研究方法，拉曼光谱是一种非接触、无损的提供物质组成和结构等生物化学信息原位探测技术手段，其不需要特殊繁杂的样品预处理，可以避免样品污染以获得原本的样品信息。而共聚焦显微拉曼光谱仪在拉曼光谱仪的基础上，在光路中引入针孔，激光通过针孔聚焦为微小光斑，只有在焦平面上的样品产生的拉曼信号可以通过共聚焦孔回收至光谱，提高了信噪比和空间分辨率，还能有效的减少荧光干扰。对样品微区进行无损的拉曼光谱分析和2D扫描，可以直观地呈现生物样品化学组成与分布特征。近年来，共聚焦显微拉曼光谱已经逐渐应用在生物组织和细胞检测方面。

足丝是贻贝足腺体的外在表现形式，本文结合扫描电镜和共聚焦显微拉曼光谱对深海和浅海贻贝的足组织进行分析，从贻贝足丝的表观差异到贻贝足腺体的分泌蛋白组分和分布特征，探讨两种贻贝足组织分泌蛋白的差异对生成足丝的影响以及对环境适应机制，可以利用拉曼光谱成像技术研究不同环境下的贻贝足腺体分布特征，其对工业上生产应对不同环境生产高效理想粘性复合材料具有指示意义。

1 实验部分

1.1 样品制备

深海贻贝(Bathymodiolusplatifrons)样品于2017年“科学号”冷泉航次取自南海冷泉大陆坡福尔摩沙脊“Fanmaoqu”位点[图1(b和c)]，采样过程由“发现”号水下缆控机器人(ROV)完成。浅海贻贝(Mytilusedulis)来自于大连小平岛。样品采集至甲板后立即用海水冲洗，解剖的足组织于-80 ℃冻存。在-25 ℃的温度下，使用冷冻切片机(HM 505 E, Germany, 69190 Walldorf)切下10 μm厚度的足组织切片，将其固定在载玻片上用于拉曼探测分析。

图1 (a) 贻贝足丝形成模式图；(b) 深海贻贝(Bathymodiolus platifrons)的采样位点的地形图；(c) 深海贻贝(Bathymodiolus platifrons)和浅海贻贝(Mytilus edulis)足、足丝、粘附盘结构图

Fig.1(a)Themodelofmusselbyssusformation; (b)Samplingsiteofdeep-seamussels(Bathymodiolusplatifrons); (c)Structuralimageoffoot,byssusandadhesiveplaqueofmussel(Bathymodiolusplatifrons)andmussel(Mytilusedulis)

1.2 仪器

共聚焦显微拉曼光谱仪(alpha 300R+, WITec, Ulm, Germany)(图2)用于贻贝足的单谱和成像分析，激发光源波长为532 nm，显微镜物镜为50×/0.55(Zeiss, EC, Epiplan-Neofluar, Germany)，到达样品处的激光功率为20 mW，UHTS300型光谱仪搭配600刻线光栅使光谱采集范围为0～3 000 cm-1，分辨率为3 cm-1。进行光谱采集时积分时间为1.5 s，累积次数为10，划定面扫描区域，设置x和y方向的像素点，步长为500 nm。使用WITec Project plus软件对拉曼光谱数据进行处理，analysis是通过对某组分的特征峰区域进行单变量成像，进而整合所检测区域的多个组分图像得到各组分相对分布的2D拉曼光谱图像。

图2 WITec共聚焦拉曼光谱仪部件组成以及光路模式图

1: 透镜式UHTS拉曼谱仪系列；2: 光子晶体光纤；3: CCD探测器；4: 滤光片装置；5: 激光光源；6：光纤；7：柯勒白光照明；8: 物镜；9：聚焦用的Z轴电机；10：压电扫描台与机械平台

Fig.2ImageofcomponentsofconfocalRamanmicroscopy(WITec)andlightpath

1: Ultra-high throughout spectrometer; 2: Optical fiber; 3: CCD; 4: Filter; 5: Excitation laser; 6: Optial fiber; 7: Kolver lighting source; 8: Objective lens; 9: Z-axis motor; 10: XY-axis motor

2 结果与讨论

2.1 深海和浅海贻贝足丝的表观特征

结合深海贻贝和浅海贻贝足丝的形态学知识和扫描电镜表征(图3)，两种贻贝足丝特征如下：深海贻贝足丝稀疏而宽粗，粗度约为400 μm，其外皮表面较粗糙杂乱，粘附盘较大；浅海贻贝足丝繁多而纤细，粗度约为70 μm，其外皮表面较光滑平整，粘附盘较小。两种贻贝足丝形态学表观相差很大，而足丝由贻贝足腺体分泌的蛋白在各种作用下生成，所以足丝表观差异是贻贝足腺体差异的外在表现形式，所以检测两种贻贝足腺体的组成以及分布对了解两种足丝差别具有重要意义。

2.2 深海(Bathymodiolus platifrons)和浅海贻贝(Mytilus edulis)足的组分检测以及分布特征

由于样品进行冷冻切片，受环境影响失水，镜下形态改变，且两种贻贝足的尺寸存在差异，在未经染色的条件下无法保证两种贻贝测定时位置一致性，所以本实验对两种贻贝的足腺体局部进行拉曼检测和成像，通过多点位多光谱重复检测的方式确定腺体间的临界位置。

拉曼光谱(如图4和图5)表明两种贻贝足蛋白种类基本相同，都存在位于1 667 cm-1的amide Ⅰ和位于1 230～1 340 cm-1的amide Ⅲ蛋白质骨架信号，基本表现为1 242，1 269，1 318和1 337 cm-1四个拉曼峰。而Amide Ⅲ的四个峰的相对强度变化又可以表明蛋白质结构差异，其中核心腺体的蛋白质表现为有序的β重叠或螺旋蛋白质高级构象，对应谱图表现为位于1 242和1 269 cm-1位置的两个峰的峰强度相对其他两个较高，与胶原蛋白preCol的二级蛋白质结构一致，而外皮和粘附盘腺体的蛋白构象无序，其光谱上表现为位于1 242和1 269 cm-1位置的两个峰峰强度相对较低。

图3 贻贝足丝扫描电镜图

上方为深海贻贝(Bathymodiolusplatifrons)，(a)和(c)分别为其粘附盘60倍和10 000倍电镜图，(b)和(d)分别为其足丝190倍和1 000倍电镜图；下方为近海贻贝(Mytilusedulis)，(e)和(g)分别为其粘附盘150倍和10 000电镜图，(f)和(h)分别为其足丝1 100倍和10 000电镜图；(a)标尺为500 μm，(b)和(e)标尺为300 μm，(c)和(g)标尺为5 μm，(d), (h)和(f)标尺为50 μm

Fig.3SEMofmusselfootbyssus

Upper part is deep-sea mussel, (a) and (c) is SEM of deep-sea mussel plaque 60× and 10 000× respectively, (b) and (d) is SEM of deep-sea mussel byssus 190× and 1 000× respectively; below part is shallow sea mussel, (e) and (g) SEM of shallow-sea mussel plaque 150× and 10 000× respectively, (f) and (h) is SEM of shallow-sea mussel byssus 150× and 10 000× respectively. Scale bar: (a) 500 μm，(b) and (e) 300 μm，(c) and (g) 5 μm，(d), (h) and (f) 50 μm

此外，三个腺体组成上也存在差异，外皮腺体和粘附盘腺体由特殊的蛋白质组成，拉曼光谱表现为位于643，830，850和1 615 cm-1四个峰位置的酪氨酸(Tyr)信号以及由酪氨酸后翻译修饰羟基化形成的拉曼信号峰位于785 cm-1的-3,4-二羟基苯丙氨酸(多巴，DOPA)信号[8]，表明外皮腺体(mfp-1)和粘附盘腺体(mfp2-6)存在酪氨酸和多巴。谱图还呈现了位于1 006 cm-1的苯丙氨酸(Phe)信号[9]，其为mfp-2的主要组分，表明了足蛋白-2的存在。相对于深海贻贝，浅海贻贝的拉曼谱图表现出高强度的位于1 043 cm-1位置的胶原蛋白信号[8]。

本实验对两种贻贝的三个腺体的局部区域进行了拉曼成像，得到了2D拉曼彩色分布图(如图4和图5)，其形象的展现了三个腺体区域的局部界限与分布，其中红色、蓝色和绿色分别与外皮、核心和粘附盘腺体区域一一对应，黄色区域代表除三种腺体外贻贝足组织的剩余组分。2D拉曼彩色分布图表明两种贻贝足组织组分分布特征：浅海贻贝的核心和粘附盘腺体区域分布较分散，即区域中夹杂零散的黄色部分，而外皮腺体分布较集中；深海贻贝的核心和粘附盘腺体区域分布相对集中，即黄色区域分布集中，外皮腺体区域较集中。

2.3 贻贝足腺体以及足丝与环境的关系

贻贝足腺体分泌蛋白形成足丝，足丝是足腺体的外在表现形式，所以足腺体分布特征决定了的足丝形态特征。深海贻贝和近海贻贝表现出较大差异的足丝表观和内部足腺体分布，这可能源于两种贻贝对各自生存环境的适应机制：本实验所用的深海贻贝生存在中国南海冷泉繁茂区，附着于自生碳酸盐岩上，需要利用冷泉渗漏的甲烷生存，其栖息环境表现为高压、黑暗、低温、富甲烷、富硫化氢结合等，贻贝足丝较粗，其强度、韧性相对较好，即便受到海流或其他地质活动影响，有利于贻贝安稳的固定在冷泉渗漏区域来生存；而浅海贻贝生存在大连小平岛，水域环境温度较高，受人类活动影响较大，浅海海流较大，在受海流扰动时贻贝足丝较细有利于贻贝断开单个足丝进行迁徙重新附着。除海流外，pH、压力、温度等理化环境参数以及粘附基质也可能造成两种贻贝足和足丝的形态结构差异。所以贻贝为适应不同环境表现出的贻贝足丝的高粘附强度、高韧性、强耐水性的性质，这些有效的粘附蛋白是一种高效的高聚天然生物胶黏剂，其为工业生产适应多种复杂环境应用的聚合物材料提供理论基础。

图4 中国南海冷泉贻贝足腺体的拉曼光谱图

(a)：三个足腺体的拉曼光谱，(b)：外皮腺体和核心腺体的2D拉曼彩色图，核心腺体(1 196～1 300/1 300～1 390 cm-1，蓝色)，外皮腺体(1 596～1 630 cm-1，红色)；(c)：核心腺体和粘附盘腺体的2D拉曼彩色分布图，核心腺体(1 196～1 300/1 300～1 390 cm-1，蓝色)，粘附盘腺体(1 596～1 630 cm-1，绿色)，标尺条为4 μm

Fig.4RamanspectraimageofmusselfootglandsfromcoldseepattheSouthChinaSea

(a): Raman spectra of three foot glands；(b): 2D Raman color-coded image of cuticleand core gland, core gland (ratio of integration of 1 196～1 300 to 1 300～1 390 cm-1, blue), the cuticle gland (1 596～1 630 cm-1, red)；(c): 2D Raman color-coded image of core and plaque gland; core gland (ratio of integration of 1 196～1 300 to 1 300～1 390 cm-1, blue), the plaque gland (1 596～1 630 cm-1, green)；Scale bars: 4 μm

图5 大连小平岛贻贝(Mytilus edulis)足腺体的拉曼光谱图

(a)：三个足腺体的拉曼光谱，(b)：外皮腺体和核心腺体的2D拉曼彩色图，核心腺体(1 196～1 300/1 300～1 390 cm-1，蓝色)，外皮腺体(1 596～1 630 cm-1，红色)；(c)：核心腺体和粘附盘腺体的2D拉曼彩色分布图，核心腺体(1 196～1 300/1 300～1 390 cm-1，蓝色)，粘附盘腺体(1 596～1 630 cm-1，绿色)，标尺条为10 μm

Fig.5Ramanspectraimageofmusselmussel(Mytilusedulis)footglandfromDalianXiaopingisland

(a): Raman spectra of three foot glands, (b): 2D Raman color-coded image of cuticleand core gland, core gland (ratio of integration of 1 196～1 300 to 1 300～1 390 cm-1, blue), the cuticle gland (1 596～1 630 cm-1, red)；(c): 2D Raman color-coded image of core and plaque gland；core gland (ratio of integration of 1 196～1 300 to 1 300～1 390 cm-1, blue), the plaque gland (1 596～1 630 cm-1, green)；Scale bars: 10 μm

3 结 论

分别对浅海贻贝和深海贻贝足组织切片进行拉曼检测和成像，得到了三个腺体的拉曼光谱以及腺体局部区域的2D拉曼彩色分布图。拉曼光谱表明两种贻贝足腺体组成：核心腺体表现为有序高级的蛋白构象，外皮和粘附盘表现为丰富的酪氨酸和多巴组成；浅海贻贝在1 043 cm-1位置有高强度的胶原蛋白信号。拉曼成像呈现两种贻贝腺体分布特征：深海贻贝表现为较为集中的腺体分布，浅海贻贝腺体分布较为分散，表明贻贝为适应不同环境形成不同的腺体分布机制。共聚焦显微拉曼光谱为不同环境下生存贻贝的足腺体分布特征研究提供技术方法，是一种潜在的研究开发适用于不同环境要求的新型高效人工聚合物探测技术。