刘静，李湘利，苗仙仙，魏海香，赵敏，薛丽萍

(济宁学院 生命科学与工程系，济宁市特色农产品高值化加工工程技术研究中心，山东 曲阜 273155)

自Harman提出自由基理论以来，机体氧化产生的自由基与衰老、疾病的关系备受关注[1]。自由基过剩可破坏机体功能和蛋白质、核酸、脂质等生物大分子结构，引发关节炎、动脉粥样硬化、老年痴呆、糖尿病、癌症等疾病[2]。自由基是导致油脂氧化的重要因素，食品的质地、风味、色泽等品质变化很可能是自由基导致的[3]。

鸡枞菌(Termitomycesalbuminosus)营养丰富，味道鲜美，素有“山珍之最、苗中之冠”的美称，有益胃、疗痔止血、治痔等功效[4]。鸡枞菌含有人体所需的氨基酸、蛋白质、维生素、钙、磷、核黄酸等营养成分及多酚、纤维素酶、脑苷等成分，是补充人体所需物质的选择之一[5]。鸡枞菌中的生物活性成分多酚、多糖、黄酮等常被用在修复损伤器官、提高免疫力、消炎镇痛及调节身体机能等方面[6]。

研究表明，鸡枞菌酶解液及饮料制品具有较强的抗氧化活性[7]。为充分利用鸡枞菌资源，应用蛋白酶进行高效提取加工，旨在制备具有抗氧化活性，集多糖、蛋白质及活性肽等功效成分于一体的营养液，为功能性食品的开发提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡枞菌：购于金乡联盛菌业有限公司，采后于55 ℃热风干燥至恒重，粉粹过60目筛，得菌粉备用。

1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH·)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS+·)、碱性蛋白酶(酶活100 U/mg)、中性蛋白酶(酶活100 U/mg)、木瓜蛋白酶(酶活800 U/mg)、菠萝蛋白酶(酶活500 U/mg)：上海金穗生物有限公司；其他试剂：均为国产分析纯。

TDL-60B低速台式离心机 上海安亭仪器厂；PHS-3C pH计 上海仪电仪器有限公司；723PC分光光度计 上海菁华仪器有限公司；FCD2000电热恒温鼓风干燥箱 上海琅玕设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 鸡枞菌酶解工艺

鸡枞菌粉→加蒸馏水→pH调整→加蛋白酶→保温酶解→100 ℃灭酶→离心(3000 r/min、30 min)→取上清液→鸡枞菌酶解液。

1.2.2 蛋白酶的筛选

选取碱性蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶+菠萝蛋白酶(1∶1)、木瓜蛋白酶+中性蛋白酶(1∶1)复合酶，在料液比1∶20、加酶量5000 U/g及推荐温度和pH下酶解2.0 h，以水解度和DPPH·、ABTS+·、O2-·清除率为指标，确定最佳蛋白酶，条件见表1。

表1 4种蛋白酶的酶活力和作用条件Table 1 Enzyme activities and action conditions of four proteases

1.2.3 单因素试验

选择最佳蛋白酶，在加酶量5000 U/g、温度50 ℃、pH 9、酶解2.0 h的条件下，研究料液比(1∶30、1∶25、1∶20、1∶17、1∶14)对水解度和DPPH·清除率的影响；在料液比1∶25、温度50 ℃、pH 9、酶解2.0 h条件下，研究加酶量(2000，3000，4000，5000，6000 U/g)对水解度和DPPH·清除率的影响；在料液比1∶25、加酶量3000 U/g、pH 9、酶解2.0 h的条件下，研究温度(40，45，50，55，60 ℃)对水解度和DPPH·清除率的影响；在料液比1∶25、加酶量3000 U/g、温度45 ℃、酶解2.0 h的条件下，研究不同pH(7，8，9，10，11)对水解度和DPPH·清除率的影响；在料液比1∶25、加酶量3000 U/g、温度45 ℃、pH 9的条件下，研究酶解时间(1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h)对水解度和DPPH·清除率的影响。

1.2.4 正交试验

在单因素试验基础上，以水解度和DPPH·清除率为指标，选取加酶量(A)、pH(B)、酶解温度(C)和酶解时间(D)4个因素进行L9(34)正交试验，制备酶解液，因素与水平见表2。

表2 正交试验因素与水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.5 水解度的测定

采用GB 5009.235-2016酸度计法测定氨基酸态氮含量(X)[8]，采用GB 5009.5-2016凯氏定氮法测定总氮含量(Y)[9]，计算水解度(DH)[10]。

1.2.6 自由基清除率的测定

于最佳条件制备酶解液，并稀释(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg/mL)备用，以同浓度Vc为对照。

1.2.6.1 DPPH·清除率的测定

参照Floegel A等[11]的方法调整。酶解液2 mL，加入2 mL 0.01 mmol/L的DPPH·溶液，室温避光反应30 min，以无水乙醇为参比，在517 nm测定吸光值(A1)；测定同体积无水乙醇和DPPH·溶液混匀后的吸光值(A2)及2 mL样品溶液和2 mL无水乙醇混匀后的吸光值(A3)，计算DPPH·清除率。

1.2.6.2 ABTS+·清除率的测定

参考李湘利等[12]的方法调整。用2.45 mmol/L的过硫酸钾配制7 mmol/L的ABTS+·储备液，避光静置12 h后用95%乙醇稀释得ABTS+·测试液，使其在734 nm的吸光值为0.7±0.02。吸取1 mL酶解液，加入4 mL ABTS+·测试液，混匀静置5 min后测吸光值(A)，并测定95%乙醇加4 mL ABTS+·测试液的吸光值(A0)，计算ABTS+·清除率。

1.2.6.3 O2-·清除率的测定

参考杨志刚等[13]的方法调整。吸取3 mmol/L邻苯三酚溶液0.3 mL，加入2 mL酶解液，用pH 8.2的Tris-HCl缓冲液定容至9 mL，以蒸馏水为参比，在325 nm下每30 s测一次吸光值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标进行线性回归，直线斜率为反应速率ΔA0、ΔA，计算O2-·清除率。

式中：ΔA0为邻苯三酚的自氧化法速率；ΔA为加酶解液后邻苯三酚自氧化法速率(单位均为每分钟吸光值增加值)。

1.2.7 数据统计方法

采用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行结果分析，用Microsoft Excel 2003的FORECAST函数计算自由基清除50%所需酶解液浓度(IC50)。

2 结果与分析

2.1 水解用酶的确定

图1 不同酶的酶解效果Fig.1 The enzymatic hydrolysis effect of different enzymes

注：1为碱性蛋白酶；2为中性蛋白酶；3为菠萝蛋白酶；4为木瓜蛋白酶；5为碱性蛋白酶+菠萝蛋白酶；6为木瓜蛋白酶+中性蛋白酶。

由图1可知，碱性蛋白酶和碱性蛋白酶+菠萝蛋白酶的水解度最高，碱性蛋白酶水解的酶解液对DPPH·和O2-·的清除率较高，分别达到86.67%和54.55%，各酶解液对ABTS+·的清除率差异不大。这与各蛋白酶的酶切位点不同，与所得活性多肽、水解度及抗氧化产物提取率不同有关[14]。方差分析表明，碱性蛋白酶酶解液对DPPH·和O2-·的清除率显著高于其他处理(P<0.05)。因此，选择碱性蛋白酶制备酶解液。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 料液比对酶解效果的影响

图2 料液比对水解度和DPPH·清除率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on hydrolysis degree and DPPH· clearance rate

由图2可知，随着料液比增大，水解度不断升高，在料液比1∶17时达最大值66.04%。这是因为随着料液比增大，酶和底物的接触几率增大，酶解更充分，但产物浓度增大也会抑制酶解反应[15]。DPPH·清除率随着料液比增大呈现先增大后减小的趋势，在料液比1∶25时清除率最高，可达48.81%(P>0.05)。为突出酶解液的抗氧化作用，选择料液比1∶25为最佳料液比。

2.2.2 加酶量对酶解效果的影响

图3 加酶量对水解度和DPPH·清除率的影响Fig.3 Effect of the additive amount of enzyme on hydrolysis degree and DPPH· clearance rate

由图3可知，随着加酶量增加，水解度升高，这与蛋白质被水解为低分子肽、氨基酸等产物有关[16]。随着加酶量增加，DPPH·清除率呈先上升后下降的趋势，在加酶量3000 U/g时清除率最高，达45.18%(P<0.05)，加酶量高于3000 U/g，酶解液的抗氧化能力减小，这可能是加酶量增大，酶和底物接触更充分，部分抗氧化物质被酶解为无抗氧化活性产物所致[17]。综合考虑，选择加酶量2500，3000，3500 U/g进行正交试验。

2.2.3 酶解温度对酶解效果的影响

图4 酶解温度对水解度和DPPH·清除率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on hydrolysis degree and DPPH· clearance rate

由图4可知，随着温度升高，水解度呈先升后降的趋势，超过45 ℃水解度降低。因为酶在最适温度范围内，升高温度可促进酶解反应，水解度增大；但温度高于最适温度时，酶稳定性降低，催化活性减弱，反应被抑制[18]。DPPH·清除率呈先升后降的趋势，温度50 ℃达到最高清除率58.56%(P<0.01)。这与温度过高，酶活性减弱，多肽等抗氧化活性降低有关。水解度和DPPH·清除率在45～55 ℃相对较高，故选择45，50，55 ℃进行正交试验。

2.2.4 pH对酶解效果的影响

图5 pH对水解度和DPPH·清除率的影响Fig.5 Effect of pH value on hydrolysis degree and DPPH· clearance rate

由图5可知，随着pH增大，水解度呈先增大后减小的变化趋势，在pH 8时达到最大值41.74%，随后逐渐减小，这是pH过高引起酶结构和活性改变所致[19]。pH 9时DPPH·清除率达到最大值64.59%(P<0.01)。pH 7～9时，水解度和DPPH·清除率相对较高，故选择pH 7、pH 8、pH 9进行正交试验。

2.2.5 酶解时间对酶解效果的影响

由图6可知，随着时间的延长，水解度增大。因为酶逐渐对底物进行酶解，所以水解度逐渐增加[20]。DPPH·清除率随着时间延长呈先升后降的趋势，酶解2.0 h时达最大值61.74%(P<0.01)。这可能是酶解时间过长，抗氧化多肽等活性物质被分解所致。故选择酶解1.5，2.0，2.5 h进行正交试验。

图6 酶解时间对水解度和DPPH·清除率的影响Fig.6 Effect of enzymolysis time on hydrolysis degree and DPPH· clearance rate

2.3 正交试验结果

固定料液比1∶25，选取加酶量(A)、pH(B)、酶解温度(C)及酶解时间(D)为试验因素，以DPPH·清除率和水解度为指标，设计L9(34)正交试验，结果见表3。

表3 酶解工艺优化正交试验设计和结果Table 3 Orthogonal experimental design and results of enzymatic hydrolysis technology optimization

由表3可知，对酶解液抗氧化活性影响的因素顺序为B>D>A>C，即pH对抗氧化活性影响最大，酶解温度的影响最小；最优条件为A3B1C1D3。影响水解度的因素顺序为A>C>D>B，最优条件为A3B1C2D2。为深入探讨酶解对抗氧化活性的影响，确定最优条件为加酶量3500 U/g，pH 7，45 ℃酶解2.5 h。

表4 DPPH·清除率方差分析Table 4 Analysis of variance on DPPH· clearance rate

注：P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。

由表4可知，在所选因素水平范围内，pH(B)对抗氧化性的影响极显著(P<0.01)，酶解时间(D)的影响显著(P<0.05)，加酶量(A)与酶解温度(C)的影响不显著(P>0.05)。在正交优化条件下进行验证试验，所得鸡枞菌酶解液对DPPH·的清除率可达73.23%，水解度达44.6%，均高于其他处理。

2.4 自由基清除试验结果

2.4.1 对DPPH·的清除能力

图7 酶解液对DPPH·的清除能力Fig.7 Scavenging ability of enzymatic hydrolysate to DPPH·

由图7可知，随着酶解液浓度增大，DPPH·清除率逐步升高，在0.4～1.2 mg/mL时趋于平缓，酶解液浓度为1.2 mg/mL时DPPH·清除率最高，达66.76%，其清除DPPH·的IC50为0.25 mg/mL，对DPPH·的清除能力低于同浓度Vc的清除能力(P<0.01)。

2.4.2 对ABTS+·的清除能力

由图8可知，随着酶解液浓度增加，ABTS+·清除能力增强，酶解液浓度为1.2 mg/mL时清除率达94.41%，清除ABTS+·的IC50为0.39 mg/mL，对ABTS+·的清除能力低于同浓度Vc的清除能力(P<0.01)。

2.4.3 对O2-·的清除能力

图9 酶解液对O2-·的清除能力Fig.9 Scavenging capacity of enzymatic hydrolysate to O2-·

由图9可知，随着酶解液浓度增大，O2-· 清除能力逐渐升高，酶解液对O2-· 的清除率在1.2 mg/mL时达到最大值54.77%，对O2-· 的IC50为1.09 mg/mL，酶解液对O2-·的清除能力低于同浓度Vc的清除能力(P<0.01)。

3 结论

应用蛋白酶对鸡枞菌进行酶解，在单因素试验基础上进行正交试验，得出适宜鸡枞菌水解的蛋白酶为碱性蛋白酶，最佳工艺条件为料液比1∶25，加酶量3500 U/g，pH 7，酶解温度45 ℃，酶解时间2.5 h，此条件下所得鸡枞菌蛋白水解度为44.6%，DPPH·清除率为73.23%。

鸡枞菌酶解液浓度1.2 mg/mL时，对DPPH·、ABTS+·、O2-·的清除率分别达到最大值66.76%、94.41%、54.77%，其IC50分别为0.25，0.39，1.09 mg/mL。这说明鸡枞菌酶解液具有较强的抗氧化能力，可用于功能性食品的开发。