好氧颗粒污泥胞外聚合物组分特征分析

2020-03-20王玉莹支丽玲马鑫欣

哈尔滨工业大学学报 2020年2期

王玉莹，支丽玲，马鑫欣，王硕,2,3，李激,2,3

(1.江南大学环境与土木工程学院，江苏无锡 214122； 2.江苏省厌氧生物技术重点实验室(江南大学)，江苏无锡 214122；3.江苏省高校水处理技术与材料协同创新中心，江苏苏州 215009)

好氧颗粒污泥(AGS)技术作为一种新型的污水处理方法，在小试和中式装置中已被广泛研究，部分地区尝试将该技术应用于工业印染废水、含核废料废水的处理中，目前已取得显著成果[1-3].胞外聚合物(EPS)是AGS的重要组成部分，由微生物生长代谢的分泌物、细胞裂解产物和吸附的小分子化合物组成，成分复杂，主要特征物质包括蛋白质(protein, PN)和多糖(polysaccharide, PS)类以及少量的腐殖酸、富里酸和核酸类物质[4-5]，具有良好的絮凝性，Nielsen等[6]证明了EPS是促进AGS形成并提高AGS稳定性的关键因素.

按照组分和形态的不同，EPS可分为松散型胞外聚合物(soluble microbial products-EPS, SMP-EPS)、附着型胞外聚合物(loosely bound-EPS, LB-EPS)和紧密结合型胞外聚合物(tightly bound-EPS, TB-EPS)[7].Liao等[8]研究发现，EPS的组分和质量分数会对微生物絮凝、污泥沉降性和脱水性产生影响.TB-EPS中蛋白质质量分数增加会促进AGS的形成，LB-EPS中的某些蛋白质会影响污泥的电负性和脱水性[9].Tay等[10]认为TB-EPS中β-多糖可提高微生物间的黏附力，强化AGS结构稳定性.Adav等也发现不溶性多糖是AGS的支撑结构，可保证AGS具有较高的强度[1].相反，Liu等[7]认为污泥中的非细胞蛋白质核心为AGS稳定运行提供了骨架结构.因此，深入解析EPS不同组分的功能作用，有助于推动AGS技术的发展.目前，国内外针对EPS在AGS形成与稳定过程中的作用研究已经较多，但缺乏对EPS中功能组分和特性变化的详尽解析，限制了AGS技术的发展.

本文以接种污泥、实验室培养的好氧颗粒污泥(AGS-laboratory, AGS-LAB)和污水处理厂培养的好氧颗粒污泥(AGS-wastewater treatment plant, AGS-WWTP)为研究对象，通过傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)和三维荧光光谱(excitation-emission-matrix spectra, 3D-EEM)等技术对AGS形成过程中污泥EPS的组成成分和特性进行相关分析，旨在研究污泥颗粒化过程中EPS 不同组分的变化特征，以期为AGS技术的发展和应用提供理论支撑.

1 实验

1.1 实验装置

实验室和污水处理厂实验反应装置均采用有机玻璃制成的圆柱形SBR，前者高100 cm，内径8 cm，有效容积约为4 L；后者高60 cm，内径30 cm，有效容积约为42 L.反应器底部均装有曝气系统，曝气量大小由转子流量计控制，充氧期间溶解氧控制在5～8 mg/L.运行周期4 h，其中进水60 min、曝气时间由145 min逐渐增加到170 min，沉降时间由30 min逐渐降低到5 min.污泥泥龄20 d.

1.2 接种污泥与进水水质

接种污泥取自无锡市某污水处理厂好氧池活性污泥，外表呈黄褐色，较为松散.实验室运行反应器进水采用人工配水，以CH3COONa为碳源，NH4Cl 为氮源，K2HPO4为磷源，单位MLSS进水污泥COD负荷为0.39 kg/(kg·d).此外，还添加了少量的微量元素，以保证细菌正常的生长代谢活动.污水处理厂运行反应器进水为旋流沉砂池出水，大部分为生活污水，含有少量工业废水，进水污泥负荷平均为0.18 kg/(kg·d)，水质波动较大.

1.3 分析方法

1.3.1 胞外聚合物和生物量的测定

EPS的提取采用NaOH法[11]，首先将10 mL待测样品置于50 mL离心管中，超声解体，分别在2 000，5 000和10 000 r/min的转速下离心15 min，收集上清液，即为SMP-EPS、LB-EPS和TB-EPS.用考马斯亮蓝法和蒽酮-硫酸比色法对EPS中蛋白质和多糖质量分数进行测定[9].

1.3.2 FTIR特性分析[12]

采用IRTrace-100型傅里叶变换红外光谱仪(IRTrace，日本岛津)对样品进行官能团鉴定.具体操作方法如下：首先将污泥EPS样品置于LABCONCO冻干机上进行冻干处理，将处理好的样品粉末和KBr以合适的比例混合后在研磨机上研磨，使用压片机压片并用红外光谱仪进行光谱扫描.

1.3.3 三维荧光特性分析[13]

首先将待测样品置于岛津总有机碳分析仪上检测DOC质量浓度，若DOC质量浓度太高，可用去离子水稀释直到DOC质量浓度低于10 mg/L，采用日立F7000荧光分光光度计进行三维荧光(日立F7000，日本日立)测试.本实验以10 nm为增量，激发波长从200 nm扫描至400 nm，发射波长从280 nm扫描至500 nm，扫描速度为12 000 nm/min.

1.3.4 水解氨基酸测试方法

取污泥EPS样品约1 mL，先加入1 mL浓盐酸，再加7 mL的HCl溶液(6 mol/L)，充氮气后封管，在烘箱内120 ℃水解22 h；再加入4.8 mL的NaOH溶液(10 mol/L)中和，在25 mL容量瓶中定容，用滤纸过滤、离心；取400 μL澄清样品置于样品瓶，最后通过Agilent1260高效液相色谱仪(Agilent1260，美国)测定.

1.3.5 GC-MS分析[14]

气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)(QP2010Ultra，日本岛津)可对有机物进行定性和定量分析.通过HCl和NaOH溶液调节样品的pH，分别对EPS中的中性、酸性和碱性有机物进行萃取，最后通过QP2010Ultra GC-MS对有机物鉴定.

2 结果与讨论

2.1 EPS变化

2.1.1 EPS组分变化特征

具有黏附特性的EPS可促进微生物絮凝，缩短污泥颗粒化进程，并提高AGS结构稳定性[15].此外，蛋白质和多糖比例(PN与PS比)变化会影响污泥表面的亲疏水性、带电性和微生物群落结构的完整性[16].AGS-LAB中EPS的变化如图1(a)所示，在接种污泥颗粒化过程中，EPS迅速增长，由接种污泥的84.36 mg/g增加到AGS-LAB的106.47 mg/g，以蛋白质增加为主，表明蛋白质在污泥颗粒化过程中发挥重要作用.AGS-LAB的EPS中多糖维持在18.8 mg/g左右，变化较小；PN与PS比呈现逐步上升的趋势，由接种污泥的4.27上升到AGS-LAB的6.65，PN与PS比的增加表明AGS-LAB中EPS疏水性提高，相应污泥表面的 Gibbs 自由能下降[17]，污泥之间的黏附性提高，有利于保持AGS紧密的内部结构.

AGS-WWTP的EPS变化如图1(b)所示，EPS呈现先上升后下降的趋势，反应器运行至30 d时、单位MLVSS EPS质量分数达到最大153.22 mg/g， 60 d时下降到128.23 mg/g，而EPS的变化以蛋白质为主.通过水质监测发现，反应器运行至30 d时污水处理厂工业废水受纳增多，该水质对AGS-WWTP冲击较大，污泥微生物为提高自身稳定性，会分泌大量蛋白质抵抗外界不良环境，这是该阶段蛋白质质量分数较高的原因之一[18].当进水恢复稳定后，污泥微生物对蛋白质的需求下降，因此,蛋白质的合成量降低.EPS中多糖质量分数变化较小，基本维持在15.9 mg/g，与图1(a)中多糖变化相似，该现象与Zhu等[17]研究一致，这是因为多糖中含有羧基等亲水性带负电荷基团，该物质质量分数适中时，可吸附水中游离的微小絮体，促进AGS的形成，质量分数过高则容易影响污泥絮体的稳定性，导致AGS解体，因此,EPS中的多糖在相对稳定的范围内波动.AGS-WWTP在颗粒化过程中PN与PS比也呈现逐步上升的趋势，由接种污泥的4.27上升到AGS的7.54，略高于图1(a)中AGS-LAB的6.65，推测与污水处理厂进水水质复杂有关.

2.1.2 EPS黏附性分级组分特征

AGS-LAB中各层蛋白质和多糖的变化如图2(a),(b)所示，蛋白质以TB-EPS层增加为主，由接种污泥的50.46 mg/g增加到AGS-LAB的83.14 mg/g，SMP-EPS和LB-EPS层蛋白质增量较小.SMP-EPS和LB-EPS层蛋白质位于微生物体的外侧，结构比较疏松，含水率较高，具有流变特性[19]，其质量分数较高容易导致AGS絮体化，使SVI值增大，进而导致AGS解体.TB-EPS层蛋白质分子排列密集，与细胞结合最紧密，可中和污泥中带负电荷的官能团，降低污泥的电负性，促进AGS的形成[20].多糖以SMP-EPS和TB-EPS层变化为主，SMP-EPS层多糖由接种污泥的3.04 mg/g增加到AGS-LAB的7.02 mg/g，该层多糖可通过离子键使细胞发生絮凝[21]，促进微生物聚集体的形成.TB-EPS层多糖由7.4 mg/g上升到10.2 mg/g，Chen等[22]研究发现，TB-EPS中β-多糖是构成AGS结构的骨架，该物质质量分数的升高可为AGS的稳定运行奠定基础.

图1 污泥颗粒化过程中胞外聚合物质量分数变化

AGS-WWTP中各层蛋白质和多糖的变化如图2(c),(d)所示，蛋白质以TB-EPS层增加为主，由接种污泥的50.46 mg/g增加到AGS-WWTP的103 mg/g，其增量大于AGS-LAB.SMP-EPS中蛋白质质量分数变化与图2(a)中相似，LB-EPS中蛋白质质量分数略有下降，可能与进水水质有关.图2(d)中多糖的变化与图2(b)中具有很大差异，SMP-EPS和LB-EPS中多糖质量分数皆呈递减状态，这与进水中有机物匮乏有关，处于易脱落位置的SMP-EPS和LB-EPS中多糖被AGS-WWTP作为碳源利用.TB-EPS层多糖总体呈现上升趋势，有研究发现，TB-EPS中多糖质量分数的增加可提高污泥的抗冲击负荷和抗毒性冲击能力，该变化可以很好地适应污水处理厂的进水水质[23].

图2 污泥颗粒化过程各层蛋白质和多糖的变化

2.2 FTIR光谱分析

图3 接种污泥和好氧颗粒污泥中EPS的3D-EEM图谱

2.3 三维荧光光谱分析

接种污泥、AGS-LAB和AGS-WWTP中SMP-EPS、LB-EPS和TB-EPS的三维荧光光谱如图4所示，每个污泥样品中都存在4个峰，其中峰A(λEx/λEm=220～250/280～330)和峰B(λEx/λEm=220～250/330～380)分别为芳香族蛋白类物质和酪氨酸/色氨酸类蛋白；峰C(λEx/λEm=280～310/380～455)为类富里酸；峰D(λEx/λEm=300～330/360～390)为多糖区.由图4(a),(d)和(g)可知，AGS中峰A和峰B的荧光强度皆高于接种污泥，说明在接种污泥颗粒化过程中SMP-EPS中蛋白质的增长主要以芳香族蛋白质类物质和酪氨酸/色氨酸类蛋白质为主，Dong等[31]推测酪氨酸蛋白是AGS的重要结构组分，会促进接种污泥颗粒化.此外，色氨酸类蛋白与EPS中的芳环氨基酸结构有关[32]，是一种疏水性物质，可提高AGS结构的稳定性，这与2.2傅里叶红外中2 929 cm-1吸收峰的变化具有良好对应关系.由图4(b)、(e)和(h)中可知，3种污泥样品都存在芳香族蛋白类物质(峰A)，唯有AGS-LAB存在酪氨酸/色氨酸类蛋白(峰B)，这可能是因为污水处理厂进水水质复杂，对污泥中微生物群落的冲击较大，某些有毒有害物质抑制了细菌的代谢活动，造成相关蛋白质的合成量降低，此结果也与图2(c)中测得LB-EPS蛋白质质量分数下降相符.由图4(c),(f)和(i)可知，3种污泥样品TB-EPS中都存在峰B、峰C和峰D，只是峰的强度存在差异.其中，类富里酸(峰C)在接种污泥和AGS-WWTP中强度较低，这与进水水质复杂存在一定关系[33].TB-EPS中多糖区物质主要是指β-多糖，接种污泥和AGS-WWTP中多糖质量分数较低的原因可能与微生物群落结构存在差异有关[34].

(a)～(c)接种污泥；(d)～(f)AGS-LAB;(g)～(i)AGS-WWTP;(a),(d),(g)SMP-EPS；(b),(e),(h)LB-EPS;(c),(f),(i)TB-EPS

2.4 水解氨基酸质量分数和种类分析

EPS中水解氨基酸的种类和质量分数可以反映污泥的理化性质和稳定性[35].Miller等[36]认为某些氨基酸能够影响细胞内基因的表达和多肽类物质的合成.Anfora[37]研究发现大部分功能性细菌可以合成右旋类氨基酸，该物质可以发挥信号分子的作用调节微生物群体行为，进而促进絮状污泥颗粒化并维持AGS结构稳定.由表1可知，亲水性氨基酸如丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸和半胱氨酸在污泥样品中的质量分数均较低，这有利于促进AGS的形成.AGS-LAB中半胱氨酸的质量分数为6.18 mg/g，略高于另外两种污泥样品，Liao等[8]发现，通过二硫键连接的半胱氨酸分子，在某些部位适当提高其质量分数会加强蛋白质结构的稳定性.丙氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸属于疏水性氨基酸，其质量分数在AGS样品中相对较高，EPS疏水性的提高可增强污泥微生物间的黏附力，为絮状污泥的颗粒化提供物质基础[38].此外，组氨酸、精氨酸和赖氨酸在AGS-LAB和AGS-WWTP中分别升高56.88%和137.68%、17.09%和67.4%以及60.88%和20.23%.这3种物质属于碱性氨基酸，带有正电荷，可降低细胞表面负电荷，减少微生物间静电斥力，加强污泥表面的疏水性以及保持AGS的结构完整性[39].同时，氨基酸总量由接种污泥的177.16 mg/g分别升高到AGS-LAB和AGS-WWTP的218.64和235.98 mg/g，氨基酸总量的升高也为AGS的形成奠定物质基础.

表1 EPS中水解氨基酸质量分数和种类分析