韩贝贝，张书飞，吴风霞史荣君黄洪辉

1.中国水产科学研究院南海水产研究所，广东省渔业生态环境重点实验室，农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广州510300

2.上海海洋大学水产与生命学院，上海201306

0 前言

近年来，藻华发生频率增加、规模扩大、危害加剧，已成为一个全球性的环境健康问题[1]。而中肋骨条藻(Skeletonema costatum)作为一种广温广盐性近岸硅藻，广泛分布在我国沿海地区，每年在我国沿海都会引发藻华，对海洋生态系统造成严重影响。因此，寻求一种有效的藻华治理方法显得尤为迫切。

海洋中细菌是微生物种群的重要组成部分，与藻类共同调控海洋生态系统的结构和功能[2]。在藻际环境中存在着错综复杂的菌藻互作关系，一方面，藻类对细菌生长的促进或抑制:藻类为细菌提供营养物质，促进细菌生长；藻类也可以通过释放抗菌物质杀死部分细菌[3-4]，或通过抑制细菌的密度感应系统，抑制细菌的代谢[5]。另一方面，细菌对藻类生长的促进或抑制:细菌可以重新矿化藻源物质为藻类的生长提供无机营养和必要的生长因子[6]，包括氮[7]、磷[8]、维生素[9]、铁载体[10]和生长素[11]等；有些溶藻菌可以直接或间接地抑制藻类的生长，甚至裂解藻细胞。近年来，研究发现，复杂的“藻—菌”关系在藻华的消亡过程中发挥着重要的作用。在藻华末期，溶藻菌的大量繁殖加速了藻华的衰退。溶藻菌的发现为藻华的控制提供了可能途径，因此，海洋溶藻菌的溶藻作用成为藻华治理领域的研究热点。

目前，已有大量关于溶藻菌的研究和报道，但关于嗜盐杆菌的溶藻研究还鲜有报道，以往大多数文献是关于嗜盐杆菌的分离与基因组序列分析研究的报道[12-13]，也有文献报道该属细菌在微生物工业发酵中的应用[14]等，本实验室前期从深圳大鹏湾藻华爆发海域分离筛选到了一株嗜盐杆菌(Halobacillus kuroshimensis，HSQAY1，Genbank 登陆号 JX308828)[15]，该菌株为革兰氏阳性、杆状中等嗜盐细菌，菌落呈圆形、黄橙色[12]。研究发现该菌株的上清液对中肋骨条藻具有强烈的溶藻作用，但对其溶藻作用机理尚不清楚。因此本研究以中肋骨条藻为研究对象，通过研究溶藻作用下中肋骨条藻细胞形态结构、相关生理参数以及与氮代谢、抗氧化系统相关酶活性等的变化，对其中的溶藻作用机理进行了探讨，研究结果将拓展我们对藻华过程中“藻—菌”关系的认识，对藻华的生物治理具有重要的科学意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 溶藻细菌及无菌上清液的制备

嗜盐杆菌菌株HSQAY1于深圳大鹏湾藻华爆发海域分离并保藏[15]。实验时，用接种环挑取一环菌落接种至100 mL 2216E液体培养基中，28 ℃静置活化24 h，再以1:100比例接种至2216E液体培养基中，28℃、160 rpm 振荡培养 48 h，将培养后的菌液以6000 g离心20 min、0.22 μm滤膜过滤并用平板法检验无菌后，获得溶藻菌的无菌上清液(简称上清液)。

1.1.2 实验藻种及培养条件

中肋骨条藻由近海海洋环境科学国家重点实验室(厦门大学)海洋藻类保种中心提供。藻种经活化后采用 f/2培养基[16]培养，温度20℃，光照强度100 μE·m-2·s-1，光暗周期 14 h:10 h。

1.2 实验方法

1.2.1 上清液最适浓度的确定及样品收集

随着国家“一带一路”战略的实施，中国走向世界的步伐加快，文化的交流也显得尤为重要，国际学术文化、知识资源的相互交流与促进将成为科技发展的重要推动剂。党的十九大报告中指出推动文化事业和文化产业发展，推进国际传播能力建设，讲好中国故事，展现真实、立体、全面的中国，提高国家文化软实力。而国家学术文化、科技文化的发展能够展现国家科技的实力与水平。

上清液分别按2.5%、5%、7.5%、10%(v/v)添加至指数期的中肋骨条藻藻液中，对照组为未添加上清液的正常培养，另设置一组添加10%(v/v)的2216E培养基。各组每天相同时间取1 mL藻液，卢戈试剂染色后于光学显微镜下计数，最终根据细胞计数结果绘制生长曲线，确定最适的上清液处理浓度。

根据上清液最适浓度结果，取指数期的中肋骨条藻藻液，设置3组平行并分别加入5%(v/v)的上清液进行培养，分别收集处理0 h、2 h、12 h、24 h的藻液，其中15 mL藻液用于细胞形态结构观察、15 mL藻液用于叶绿素荧光测定、4 L藻液经3 μm滤膜过滤，5000 g离心15 min后用于酶活性测定、20 mL藻液采用相同方法收集用于叶绿素a含量测定、200 mL藻液采用相同方法收集用于总氮含量测定。

1.2.2 细胞形态结构观察

向收集的藻液中加入 0.5%(v/v)戊二醛固定，光学显微镜(AX10；Carl Zeiss Meditec AG)下观察细胞形态结构并随机选取50个细胞测量其单细胞长度、单细胞直径以及胞间支持突长度。

1.2.3 总蛋白质、叶绿素a及总氮含量的测定

总蛋白质含量采用总蛋白含量测定试剂盒(南京建成生物工程公司)测定。将藻细胞重悬于生理盐水，4℃超声波破碎。细胞匀浆以4000 g、4 ℃离心10 min后取上清液，根据试剂盒操作步骤测定总蛋白质含量。

叶绿素a含量采用甲醇提取法进行测定[17]。向收集的藻细胞中加入5 mL甲醇混匀，4 ℃避光萃取24 h后，7000 g离心5 min取上清，用酶标仪(xMark；Bio-rad)测定上清液在750 nm、665 nm和652 nm波长处的吸光度。叶绿素a含量(μg·mL-1)的计算公式:

其中，A652、A665和A750分别代表上清液在652 nm、665 nm和750 nm处的吸光度，叶绿素a含量的最终结果以每107个细胞中叶绿素a含量表示(μg·107cell-1)。

其中，VMeOH代表甲醇的体积(5 mL)，Vsample代表样本的体积(20 mL)，X 代表藻细胞密度(cells·mL-1)。

细胞总氮含量参照Abreu等[18]的方法测定。将收集的藻细胞于60 ℃烘干24 h后称其干重，烘干的样品于研钵中磨成粉末状，用35 mm×35 mm的锡纸将样品包埋并精确称重之后利用C/H/N/S/O元素分析仪(Vario ELIII；Elemetar Analysensysteme Gmbh)进行测定(%)，最终结果以每 109个细胞中氮含量表示(mg·109cell-1)。

1.2.4 酶活性的测定

将收集的藻细胞重悬于相应匀浆介质中，4 ℃超声波破碎后细胞匀浆以4000 g、4 ℃离心10 min，上清液即为粗酶液。细胞抗氧化系统相关的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性以及细胞氮代谢相关的硝酸还原酶(NR)、亚硝酸还原酶(NiR)及谷氨酰胺合成酶(GS)活性均采用相应试剂盒(南京建成生物工程公司、北京百奥莱博科技有限公司)进行测定。

1.2.5 叶绿素荧光测定

藻细胞光合系统 II(PS II)中的光合荧光效率使用超便携式调制叶绿素荧光仪(MINI-PAM- II；Walz)测定。将收集的藻液暗处理30 min后测定最大量子产量Fv/Fm。在光化光条件下(光照强度设定为90 μmol·m-2·s-1)测定实际量子产量Y(II)。

1.3 数据处理与分析

数据统计分析采用one-way ANOVA(SPSS 22.0 for Windows)检验各个实验处理组之间的显著性差异(p＜0.05)。

2 结果

2.1 不同浓度上清液对藻细胞生长的影响

细胞计数结果表明，加入 10%(v/v)2216E培养基的实验组与对照组的中肋骨条藻生长趋势无显著差异(图1)，表明2216E培养基不影响中肋骨条藻的正常生长。而加入不同浓度上清液的处理组中，溶藻效果随着上清液浓度的升高而增强，5%(v/v)上清液处理后24 h内中肋骨条藻细胞处于抑制状态且大部分细胞未破裂死亡，因此本研究选用5%(v/v)的上清液浓度进行后续的实验。

2.2 溶藻作用下细胞形态结构的变化

正常培养条件下，中肋骨条藻细胞呈链状结构，单细胞呈凸镜或短圆柱状(图2a、2b)。上清液处理2 h后，藻细胞的形态结构与0 h无明显变化，细胞链状结构及单细胞结构完整(图2c、2d)。上清液处理12 h后，部分细胞链状结构发生断裂，细胞多以短链或单细胞存在，同时发现少量细胞形成泡状(图2e-2h)。24 h后，细胞多以单体存在，少见链状细胞，部分泡状细胞发生破裂降解(图2i-2l)。

图1 不同浓度上清液处理下中肋骨条藻的生长曲线Figure 1 Growth curves of Skeletonema costatum after treated with different amounts of bacterial supernatant

图2 上清液处理条件下中肋骨条藻细胞的形态结构变化Figure 2 Variation of Skeletonema costatum cells structure after treated with bacterial supernatant

溶藻作用下，单细胞长度、单细胞直径以及细胞间支持突长度的测量统计结果如图3所示。上清液处理 2 h后，中肋骨条藻单细胞长度显著增加(p＜0.01)，12 h 后达到最大值，约为 0 h 组的 2.8 倍。而单细胞直径和细胞间支持突长度在各处理组间差异均不显著。

图3 上清液处理条件下中肋骨条藻细胞的大小变化Figure 3 Cell dimension variation of Skeletonema costatum after treated with bacterial supernatant

2.3 溶藻作用下藻细胞总蛋白质、叶绿素a、总氮含量的变化

上清液处理2 h后，藻细胞内总蛋白质、叶绿素a以及总氮含量与0 h组无显著差异，而处理12 h和24 h后，藻细胞内总蛋白质含量分别下降 44%和46%(p＜0.01)，叶绿素a含量分别下降48%和56%(p＜0.01)，总氮含量分别下降 41%和42%(p＜0.01)(图4)。

2.4 溶藻作用下藻细胞抗氧化系统、氮代谢相关酶活性的变化

上清液处理2 h后，细胞内MDA含量与0 h组无显著差异，而处理12 h后，藻细胞内MDA含量急剧升高，显著高于 0 h 组(p＜0.01)。处理 24 h 后，藻细胞内MDA含量虽略有下降，但仍显著高于0 h组(p＜0.05)(图5a)。T-SOD活性在处理12 h后升高53%，显著高于 0 h组(p＜0.05)。随着处理时间的延长，T-SOD活性继续升高，24 h后活性达到0 h组的1.8倍(图5b)。POD活性随处理时间的延长呈逐渐升高的趋势，各处理组均显著高于0 h组(p＜0.05)且处理12 h和24 h后活性分别升高至0 h组的5.6倍和6.1倍(图5c)。

溶藻作用下，各处理组NR、NiR的活性均显著低于0 h组(p＜0.05)，而GS的活性在处理2 h时无显著变化，但在处理 12 h及 24 h后均显著降低(p＜0.01)(图5d-5f)。

图4 上清液对中肋骨条藻细胞蛋白质、叶绿素 a、总氮含量的影响Figure 4 The effect of bacterial supernatant on the contents of protein, chlorophyll a and nitrogen of Skeletonema costatum cells

2.5 溶藻作用下藻细胞Fv/Fm、Y(II)的变化

溶藻作用下，各处理组藻细胞的Fv/Fm和Y(II)均显著低于0 h组(p＜0.01)。处理2 h后，Fv/Fm和Y(II)分别下降 9%和 19%，且随着处理时间的延长持续下降，处理24 h后，Fv/Fm和Y(II)均下降42%(p＜0.01)(图6)。

3 讨论

3.1 细胞形态结构变化

研究表明，不同种属的骨条藻细胞在形态上存在一定的差异[19]，相同种属的骨条藻细胞长度也可能随生长周期[20]或环境条件的变化而变化[21]。此外，当骨条藻细胞进入分裂期之后，细胞由于受到某些环境胁迫而无法分裂时细胞长度也可能呈现增长的状态。如中肋骨条藻细胞在UVB紫外线胁迫条件下，细胞无法分裂且处于分裂之前的状态，从而导致细胞长度变长[22]；Cu2+通过抑制硅藻细胞对硅的吸收利用，抑制细胞分裂，最终使细胞长度增加[23]。类似的，本研究发现，溶藻作用下中肋骨条藻细胞单细胞长度显著增加，结合细胞计数结果显示5%(v/v)浓度的上清液处理下，24 h内中肋骨条藻细胞数量处于相对稳定的状态(图1)，表明溶藻作用下藻细胞的分裂活动受到抑制。因此，本研究中细胞长度的增加可能是由于溶藻物质抑制了细胞内与细胞周期相关的代谢过程，或直接作用于细胞周期调控相关过程而使细胞周期停止，细胞无法分裂而一直处于分裂前细胞增长的状态。

3.2 氧化胁迫与藻细胞完整性

图5 上清液对中肋骨条藻细胞抗氧化系统、氮代谢相关酶活性的影响Figure 5 The effect of bacterial supernatant on the activity of antioxidant and nitrogen metabolism enzymes of Skeletonema costatum cells

图6 上清液对中肋骨条藻细胞Fv/Fm、Y(II)的影响Figure 6 The effect of bacterial supernatant on the Fv/Fm and Y(II) of Skeletonema costatum cells

活性氧(ROS)是细胞内一类信号分子，在光合生物中主要由光合作用和呼吸作用等代谢过程产生，包括超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢等[24]。细胞内ROS的生成和清除通常处于平衡状态，但外界条件的刺激可打破这种平衡而使细胞产生过量的ROS，从而引起脂质过氧化，对细胞膜造成氧化损伤，破坏细胞膜的完整性与通透性。如 Liu等[25]发现添加抗生素后，中肋骨条藻细胞内产生过量ROS，破坏了细胞膜的完整性与通透性，导致细胞内 pH增加以及细胞膨胀。Qian等[26]研究了链霉素对小球藻和铜绿微囊藻生理指标的影响，结果显示ROS含量增加的同时MDA含量以及电解液渗透量均增加，表明过量ROS会对细胞造成氧化损伤，致使细胞膜通透性增大。孔赟等[27]同样发现在溶藻菌无菌滤液处理后，铜绿微囊藻细胞内 ROS含量增加，细胞膜完整性受到破坏，导致细胞内K+和Ca2+外渗。吴培枫等[28]研究发现当东海原甲藻受到溶藻菌 DH-e胁迫后，细胞ROS含量会急剧上升，同时，MDA含量增加，SOD活性增强。管伟城等[29]在溶藻菌 LP-10溶藻机制的研究中也得到类似的结果:LP-10能够刺激球形棕囊藻细胞产生过量 ROS，细胞内部氧化水平升高，抗氧化系统中的SOD和POD等酶活性出现不同程度的升高，与本文研究结果相似。本研究中，溶藻作用下中肋骨条藻细胞 MDA 含量、SOD和POD的活性均显著升高。SOD和POD活性的升高表明溶藻物质刺激中肋骨条藻细胞产生了过量的ROS。而MDA含量的显著升高则说明ROS已对细胞膜内脂质造成损伤效应，因为 MDA 是脂质过氧化的产物之一，也是衡量细胞内脂质过氧化程度的重要指标，间接反映了细胞膜系统的受损伤程度[30]。另外，光学显微镜的观察结果发现，在溶藻作用后期，中肋骨条藻细胞原生质体会在细胞一端形成泡状并逐渐膨胀破裂(图2)。因此本研究推测溶藻作用发生的原因之一可能是由于中肋骨条藻细胞的细胞膜受到过量的ROS损伤而通透性发生变化，大量胞外物质进入细胞膜内而使细胞膨胀破裂死亡。相关文献也有类似的报道[31]。

3.3 溶藻物质对中肋骨条藻细胞氮代谢的影响

氮是浮游植物生长发育过程中的重要营养元素，而硝态氮是藻类利用的主要形式[32]。硝态氮首先通过硝酸盐转运蛋白的转运进入细胞[33]，再通过 NR和NiR的催化转化为能被细胞直接利用的铵态氮[34]，随后在 GS等酶的催化反应下完成氨的同化，为叶绿素、核酸和蛋白质等富氮化合物的合成提供原料[35]。在这一系列过程中，NR、NiR和GS是关键的调节酶，在氮代谢过程中发挥着重要作用。本研究发现，溶藻作用下中肋骨条藻细胞内 NR、NiR、GS的活性均显著降低，表明溶藻物质抑制了藻细胞对氮的吸收利用，而这一抑制作用也可能影响了叶绿素、蛋白质等富氮化合物的合成，导致处理组中叶绿素a、总蛋白质以及细胞总氮含量均显著低于 0 h组(图4)。此外，有研究发现氮是藻类细胞分裂繁殖过程中的重要元素，因此，本研究中，氮的吸收利用受到抑制也可能是溶藻作用发生的一个原因，溶藻作用下中肋骨条藻细胞氮代谢过程受阻，细胞因缺氮而无法分裂。高越等[36]和Olson等[37]研究也证实了这一点，在氮限制条件下，藻细胞分裂受到抑制，细胞周期停滞于G1期或G2/M期。

3.4 溶藻物质对中肋骨条藻细胞光合系统的影响

光合作用是藻细胞中的重要代谢过程之一，为藻细胞提供有机物质和能量，光合作用的强弱直接影响着藻细胞的正常生长[38]。叶绿素a在光能收集和能量转换过程中起着重要的作用，常被用来评估藻细胞对环境胁迫反应的程度。Fv/Fm表示藻细胞PS II中的潜在最大光合能力，反映藻细胞最大光能转换效率，可作为反映光合作用变化的重要指标[39]，而 Y(II)表示藻细胞的实际光合效率。傅丽君等[40]研究发现在溶藻细菌 BS03上清液处理后，塔玛亚历山大藻细胞内叶绿素a含量和Fv/Fm随处理时间的延长和浓度的增加呈逐渐下降趋势，与本文研究结果相似。本研究中，溶藻作用下，藻细胞的叶绿素a 含量(图4b)、Fv/Fm 和 Y(II)均显著下降(图6)，表明溶藻物质对藻细胞的光合系统可能造成了一定的损伤。研究表明，光化学反应和电子传递主要依赖于类囊体上的电子载体以及相关酶的移动，光合作用受类囊体结构和流动性的影响[41]，而过量的 ROS会对光合系统包括类囊体等造成氧化损伤，从而影响藻细胞的光合作用[42-43]。因此，本研究中 Fv/Fm和Y(II)被显著抑制可能与类囊体膜受氧化损伤而不完整有关，MDA含量的显著升高也间接地印证了这一推断。Yang等[24]也认为灵菌红素是通过破坏铜绿微囊藻类囊体膜的完整性而使光合作用功能受损。此外，氮对藻细胞光合作用中光反应和暗反应的一系列酶的活性也有重要影响，在一定范围内，藻细胞的光合速率与氮的营养水平呈正相关[44]。因此，溶藻作用下，中肋骨条藻细胞内氮含量的降低也可能是藻细胞光合速率下降的原因之一。

4 结论

本研究以中肋骨条藻为研究对象，通过显微观察以及对相关生理参数及酶活性的测定，探讨了嗜盐杆菌HSQAY1对中肋骨条藻的溶藻作用机理。根据本研究结果推测嗜盐杆菌上清液中的溶藻物质可显著抑制中肋骨条藻对氮的吸收利用，细胞内蛋白质、叶绿素a等重要生命物质的合成受阻，细胞的正常代谢过程受到抑制，最终细胞分裂活动停止。同时溶藻物质的胁迫刺激中肋骨条藻细胞产生过量的活性氧，细胞膜系统受到氧化损伤而使其通透性发生变化，大量胞外物质透过细胞膜进入细胞内，细胞最终膨胀破裂死亡。