李金梅， 张志强， 刘云佳， 张东晨， 孙吉瑞， 赵文明， 陈雪， 李艺萱， 张金库

保定市第一中心医院病理科(河北保定 071000)

肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)指存在于肿瘤间质和实质内的特殊淋巴细胞群体，有免疫调控和免疫应答作用，其介导的适应性免疫具有局部持续抗肿瘤作用，可以杀伤肿瘤细胞，降低转移风险[1]。有研究显示，在三阴乳腺癌中，TILs 是提示其复发和死亡风险的标志物，伴随TILs密度的增加，其复发和病死率相应降低[2]。多数基底细胞样型乳腺癌中也存在较丰富淋巴细胞浸润[3]，提示肿瘤与机体免疫系统相互作用较强，因此免疫治疗也是人们一直努力探索的一条治疗基底细胞样型乳腺癌的途径[4]。人类黏液病毒抵抗蛋白A(MxA)，是一种干扰素触发的最大多域GTP酶，参与先天免疫系统对病毒感染的反应[5]，也是监测干扰素活性和预测干扰素治疗疗效的生物标志物[2]，2016年，Kim等[2]研究发现MxA高表达和丰富的间质淋巴细胞浸润是三阴乳腺癌患者无病生存率的独立预后因素。众所周知，基底细胞样型乳腺癌与三阴乳腺癌既存在共同点，又存在差异性。MxA、TILs与基底细胞样型乳腺癌的关系和作用机制在国内外尚未报道。为此，本研究检测MxA在基底样乳腺癌中的表达，并初步探讨其可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性收集保定市第一中心医院2009年1月至2019年4月手术切除和外院会诊66例基底细胞样型乳腺癌和22例对应淋巴结转移性癌，92例乳腺非基底样型浸润性导管癌组织做对照组。病理标本都是手术后立即取材，并固定于10%的中性甲醛液中，石蜡包埋。本实验通过医院伦理委员会的批准。

1.2 试剂 MxA(兔抗人多克隆抗体，克隆号：ab95926，Abcam公司)；Ki-67(鼠抗人单克隆抗体，克隆号：MIB-1，福州迈新生物技术开发有限公司)，通用型SP免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司)。

1.3 免疫组织化学 应用免疫组织化学SP方法，操作步骤均按试剂盒说明书进行。阳性对照参照试剂说明书，阴性对照以PBS液代替一抗。

1.4 资料分析 MxA实验结果判断：MxA在细胞胞质着色，参照文献[2]，在癌区域随机选10个高倍镜视野(×400)，每个视野计数100个细胞数，首先判断着色强度：无染色为0分，轻度染色为1分，中度染色为2分，重度染色为3分，然后判断癌细胞占所观察癌细胞的百分比：阳性细胞数目<25%为1分，25%～75%为2分，>75%为3分，然后计算染色强度和阳性细胞比率得分的乘积判定各标本的染色得分，最后计算平均分，小于等于平均分者为低表达，高于平均分者为高表达。Ki-67在细胞核染色，在每张切片上寻找10个高倍视野(×400)，每个视野计数所有癌细胞，以每个视野阳性癌细胞占所有癌细胞平均比率作为Ki-67增殖指数。TILs密度计算方法[2]：肿瘤间质浸润淋巴细胞所占面积/肿瘤间质面积。两位病理学专家采用双盲法阅片并判定结果。

1.5 统计学方法 应用SPSS 12.0统计软件，计数资料应用2检验、Fisher 精确概率法，计量资料用Mann-Whiney检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MxA在基底细胞样型乳腺癌原发灶、转移灶和非基底样乳腺癌的表达情况 MxA表达产物在细胞质，呈现棕黄色颗粒(图1)。MxA在基底细胞样型乳腺癌原发灶中的表达低于淋巴结原发灶，但差异无统计学意义(2=2.573，P=0.109)，见表1；MxA在基底细胞样型乳腺癌中的阳性表达率(51.5%)高于乳腺非基底样型浸润性导管癌(33.7%)，差异有统计学意义(2=5.039，P=0.025)，见表2。

注：A：MxA在基底细胞样型乳腺癌癌细胞高表达；B：基底细胞样型乳腺癌的肿瘤间质浸润性淋巴细胞

表1 MxA在基底细胞样型乳腺癌原发灶和淋巴结转移灶的表达情况 例(%)

表2 MxA在基底细胞样型乳腺癌和非基底样型乳腺癌的表达情况 例(%)

2.2 基底细胞样型乳腺癌中MxA表达和临床病理特征的关系 MxA的阳性表达与基底细胞样型乳腺癌pTNM分期相关，Ⅰ～Ⅱ期MxA的高表达率(57.1%)高于Ⅲ期(20%)(P=0.041)，与其他临床病理特征均不相关(P>0.05)。见表3。

表3 基底细胞样型乳腺癌中MxA表达与临床病理特征的关系 例(%)

注：*与Ⅲ期比较P<0.05

2.3 基底细胞样型乳腺癌中MxA表达和Ki-67增殖指数的关系 MxA低表达组和高表达组的Ki-67增殖指数差异无统计学意义(P=0.185)，见表4。

表4 基底细胞样型乳腺癌中MxA表达和Ki-67增殖指数的关系

2.4 基底细胞样型乳腺癌中MxA表达和肿瘤间质浸润性淋巴细胞密度的关系 部分基底细胞样乳腺癌中存在丰富的肿瘤间质淋巴细胞浸润(图1)，MxA高表达组的肿瘤间质浸润性淋巴细胞密度高于MxA低表达组，差异有统计学意义(P=0.010)，见表5。

表5 基底细胞样型乳腺癌中MxA表达和肿瘤间质浸润性淋巴细胞密度的关系

3 讨论

基底细胞样型乳腺癌是一个特殊的分子亚型，其发病年轻化、恶性度高、易复发、预后差。近年来，虽然对于基底细胞样型乳腺癌的治疗取得了一定进展，但它的疗效和预后在乳腺癌的众多亚型中仍是较差的。尽管治疗之初，患者对化疗反应较其亚型更好，但大多最终难避免耐药和复发转移的结局，导致治疗失败。

MxA本是一种具有广谱抗病毒作用的蛋白质，现发现其与多种肿瘤密切相关。目前，在肺腺癌[6]、前列腺癌[7]、结直肠癌[8]、皮肤鳞状细胞癌[9]、淋巴瘤[10]、胚胎性横纹肌肉瘤[11]等恶性肿瘤中发现Mx1基因的突变。另外有学者研究肿瘤中Mx1基因的22种突变与MxA蛋白功能变化的关系，发现了7种单点突变可能会导致MxA蛋白表达和功能的异常，进而可能影响肿瘤的形成和发展[12]。然而，MxA蛋白的功能尚存在争议，多数研究支持它是一个抑癌蛋白。如头颈部原发鳞癌的研究中发现Mx1基因存在甲基化现象并呈抑制状态[13]；MxA在高侵袭性前列腺癌细胞株PC-3M中的表达被抑制，其能在体内外抑制PC-3M细胞的游动和侵袭性[14]；MxA基因1的缺失与前列腺癌的高侵袭倾向相关[15]。

我们的研究结果显示，MxA在基底细胞样型乳腺癌中的阳性表达率(51.5%)高于非基底样型乳腺癌(33.7%)，差异有统计学意义(P<0.05)，并与基底细胞样型乳腺癌pTNM分期相关，Ⅰ～Ⅱ期MxA的高表达率(57.1%)高于Ⅲ期(20%)(P=0.041)，与其他临床病理特征均不相关，这提示MxA高表达的基底细胞样型乳腺癌患者可能有相对好的预后。这与文献报道一致。例如2016年，Kim等[2]报道MxA蛋白的高表达和丰富的间质淋巴细胞浸润是三阴乳腺癌患者无病生存率的独立的预后因素。另外，有学者报道敲除Mx1基因的前列腺细胞比MxA阳性的细胞对多西他赛的敏感性要差[16]，MxA高强度表达的乳腺癌患者对蒽环类药物更敏感。MxA在基底细胞样型乳腺癌和三阴乳腺癌的高表达，也为它们的治疗提供了新的思路和可能治疗的靶点。

据目前资料研究报道，在肺癌和乳腺癌中 miR-211过表达时可以和MxA的3′非翻译区结合，在翻译和转录水平抑制MxA的表达，进而促进细胞的增殖和浸润[17-18]，那么在基底细胞样型乳腺中MxA是否和增殖相关呢，本研究探讨了基底样乳腺癌中MxA表达和Ki-67增殖指数的关系，结果MxA高表达和低表达组的Ki-67增殖指数并无明显差异，因此有待扩大样本量进一步研究。

肿瘤浸润淋巴细胞是基于免疫系统提示预后的可靠标记物。在乳腺癌分子亚型中，肿瘤细胞和免疫系统相互作用在不同亚型中不同。以往研究结果提示三阴乳腺癌患者有更多肿瘤间质淋巴细胞反应，而且间质淋巴细胞的增加与较好的预后相关，包括降低复发和死亡风险，TILs的存在还是判断新辅助化疗疗效的独立预测因素[19]。基底细胞样型乳腺癌和三阴乳腺癌既存在共同点，又存在差异性，基底细胞样型乳腺癌中，84%肿瘤周边或癌细胞之间有不同程度的淋巴细胞浸润。在我们的实验中，MxA高表达组的基底细胞样型乳腺癌肿瘤间质浸润性淋巴细胞密度明显高于MxA低表达组，差异有统计学意义，推测基底细胞样型乳腺癌部分患者可能诱导了机体较强的免疫应答，这部分患者中MxA和肿瘤间质浸润性淋巴细胞相互作用，可能在肿瘤免疫抑制肿瘤发展过程中发挥了一定的作用，其具体机制还有待进一步研究。