周红姿, 周方园, 赵晓燕, 吴翠霞, 张广志,苑伟伟, 吴晓青, 谢雪迎, 范素素, 张新建*

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院)生态研究所, 山东省应用微生物重点实验室, 济南 250103；2.泰安市农业科学研究院, 山东 泰安 271000；3.山东蔚蓝生物科技有限公司, 山东 滨州 251700)

小麦赤霉病(wheatFusariumhead blight)是我国小麦生产上的主要病害，也是世界性的小麦重要真菌病害之一，广泛发生于世界湿润和半湿润地区。在我国赤霉病主要发生在长江中下游冬麦区、东北春麦区东部及华南冬麦区。近年来随着气候和耕作制度的变化，该病害流行区域不断扩大，目前已经发展到黄淮海麦区。2012年，我国小麦赤霉病爆发，受害面积达到1 000万hm2，约占全国小麦总面积的二分之一。麦类赤霉病是由禾谷镰刀菌复合种(Fusariumgraminearumspecies complex)引起的，在我国流行危害的主要是禾谷镰刀菌(F.graminearum)和亚洲镰刀菌(Fusariumasiaticum)，其中，黄河流域以北地区以禾谷镰刀菌为主，长江中下游地区以亚洲镰刀菌为主[1-3]。赤霉病发生后，不仅会造成产量的巨大损失，还会造成籽粒皱缩，品质下降，而且病菌在侵害作物的同时能产生多种毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)和玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)，可破坏人和动物的免疫系统，具有致癌、致畸作用，严重威胁人畜的健康安全[4-6]。

小麦赤霉病的防治技术包括培育抗病品种、加强田间管理、化学防治和生物防治等[7]。抗病育种是最经济有效的措施，但尚未发现非常理想的抗病种质资源。而仅靠田间管理难以有效控制病害发生。目前，小麦赤霉病的防治主要依赖于化学防治，随着用药面积扩大，用药量和用药频率增加，病原菌的抗药性也不断增强[7-9]。随着农业可持续发展的需要和人们环保意识的提高，生物防治措施在农业生产上的应用越来越广泛[10]。对小麦赤霉病进行生物防治研究已有报道，研究发现拮抗微生物包括芽胞杆菌、假单胞杆菌、链霉菌、变形菌等种类，部分菌株表现出良好的生防效果[11-12]。但这些研究都是以禾谷镰刀菌为防治对象，对于以亚洲镰刀菌为防治对象的研究较少。本研究以近年来赤霉病发生严重的长江中下游麦区的重要病原菌——亚洲镰刀菌为防治对象，从大田小麦赤霉病病穗上分离到的细菌菌株中筛选到一株对该病原菌具有高效拮抗活性的细菌，通过小麦盆栽试验和田间试验检测其菌体和发酵液对小麦赤霉病的防治效果，为该病害的生物防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试小麦病原菌为亚洲镰刀菌(F.asiaticum)菌株P2，从江苏省扬州市邗江区郊外麦田赤霉病病穗上分离、鉴定并保存；试验用的175株细菌菌株分离自全国各地小麦赤霉病病穗，保存于山东省科学院生态研究所生态修复创新研究室。

1.2 试剂及仪器

主要试剂：Tryptone(Oxoid)、Yeast extract(Oxoid)、25%氰烯菌酯悬浮剂(江苏省农药研究所股份有限公司)，引物由上海生工生物有限公司合成。

培养基配方及配置方法如下：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，去离子水定容至1 000 mL，115 ℃灭菌20 min。绿豆汤产孢培养基：绿豆30 g，去离子水定容至1 000 mL，煮沸去渣，121 ℃灭菌20 min。LB：NaCl 10 g，Tryptone 10 g，Yeast extract 5 g，琼脂15 g，去离子水定容至1 000 mL，pH 7.0。121 ℃灭菌20 min。LB液体培养基：NaCl 10 g，Tryptone 10 g，Yeast extract 5 g，去离子水定容至1 000 mL，pH 7.0。121 ℃灭菌20 min。

仪器设备： DNP-9082型电热恒温培养箱(上海精宏)、HZQ-Q全温振荡器(哈东联)、Q10超纯水仪(Millipore)、Universal Hood Ⅲ核酸凝胶成像仪(Bio-Rad)、flexlid PCR仪(Eppendorf)、Centrifuge 5418台式离心机(Eppendorf)、CR22GⅢ低温高速离心机(HITACHI)、XMTD-8222电热恒温水浴锅(上海精宏)、Sub-Cell GT琼脂糖凝胶电泳系统(Bio-Rad)、Mini Vortex涡旋震荡仪(北京东林昌盛)。

1.3 生防菌株的分离与筛选

1.3.1生防菌株的分离 选取小麦病穗上病健交界处的小穗，放到3%次氯酸钠溶液中浸泡2 min，取出，用无菌镊子扒开组织，露出麦粒，一起放到无菌水中涡旋振荡2 min，静置5 s，梯度稀释5次后，取1 mL稀释液涂布到LB固体培养基平板上，于28 ℃培养过夜，挑取单菌落进行纯化，保存。

取保存于-80 ℃超低温冰箱中的病原菌亚洲镰刀菌P2菌块接种到PDA平板上，于28 ℃培养48 h后，转接到新的PDA平板上，继续培养48 h。用直径2.5 mm的打孔器打成菌片，备用。

1.3.2拮抗菌的初筛 将分离获得的细菌分别接种到LB固体培养基平板上，于30 ℃培养箱中培养，每24 h观察1次菌落形态。将菌株按照菌落形态差异进行分类，从每个地点采集的菌株中取生长速度较快的菌株与亚洲镰刀菌P2菌株进行共培养试验。30 ℃培养6 d，观察P2菌株菌落生长速度和菌落半径大小。各设3个重复。

1.3.3拮抗菌的复筛 挑取细菌单菌落，分别接种于PDA平板距中心2.5 cm处的对称两点。PDA平板中央接种P2菌片，每个培养皿作为1个重复，每个拮抗菌株设3个重复，以中心只接种P2菌片的PDA平板为对照。28 ℃培养5～7 d，当对照病原菌菌丝长满整个培养皿时，测定各处理中P2的菌丝直径，计算细菌对P2菌丝的抑制率。

显微镜观察亚洲镰刀菌P2与拮抗菌Z54对峙区病原菌菌丝的变化情况。

1.4 拮抗菌的鉴定

1.4.1拮抗菌Z54的形态学鉴定 挑取活化培养的Z54单菌落，在LB平板上划线，30 ℃恒温培养16 h 和96 h，分别观察单菌落颜色、形状、大小、边缘、表面、隆起形状，透明度和菌体及芽胞的形态特征。用革兰氏染色法对菌体和芽胞进行染色观察。

1.4.2高活性拮抗菌的16S rDNA、gyrB基因序列分析与系统发育树构建 将筛选出的11株拮抗活性好的细菌单菌落分别接种到LB液体培养基中,30 ℃培养16 h 后，用细菌基因组提取试剂盒提取DNA，以此DNA为模板进行16S rDNA的 PCR扩增。通用引物为：1492 R(5’-GGCTCGAGCGGCCGCCCGGGTTACCTTGTTACG-ACTT-3’)和8F(5’-GCGGATCCGCGGCCGCT-GCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)；扩增条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52.3 ℃ 45 s，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃ 10 min[13]。扩增产物由上海生工生物公司进行测序。

根据16S rDNA序列鉴定为芽胞杆菌的7株细菌，以基因组DNA为模板进行gyrB基因的PCR扩增。引物为：UP-1 (5’-GAAGT-CATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTT-YGA-3’)和UP-2r (5’-AGCAGGGTACGGATGTG-CGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTC-AT-3’)，扩增条件为：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 8 min[12]。扩增产物由上海生工生物公司测序。

将测定的16S rDNA和gyrB基因序列，分别与GenBank和EzBioCloud数据库中的已知16S rDNA和gyrB基因序列进行同源性比较，选取属内同源性较高的细菌的基因序列进行遗传距离计算，使用MEGA7中的Muscle进行比对，并采用Maximum Likelihood法[14-15]分别绘制系统发育树。

1.5 Z54防治小麦赤霉病盆栽试验

1.5.1拮抗菌菌悬液的制备 取保存于-80 ℃的拮抗细菌菌株，在LB平板上划线，30 ℃培养24 h后转接于LB培养液中，30 ℃ 180 r·min-1培养72 h，将发酵液分成2批，一批用无菌水调整菌液浓度至1×109CFU·mL-1，用于细菌发酵液喷雾；另一批在低温条件下5 000 r·min-1离心10 min，获得菌体，用无菌水将菌体重悬，调节菌体浓度至1×109CFU·mL-1，用于细菌菌体喷雾。

1.5.2病原菌菌悬液的制备 取保存于-80 ℃的病原菌亚洲镰刀菌P2的菌块接种到PDA平板上，于28 ℃培养48 h 后，转接到PDB液体培养基里，28 ℃ 160 r·min-1震荡培养7 d，用单层纱布过滤，获得P2的分生孢子，调节孢悬液浓度至1×105CFU·mL-1，备用。

1.5.3小麦盆栽试验 小麦盆栽试验于2017—2018年在山东省科学院东院区进行。试验采用直径为33 cm、深度28 cm的塑料盆，土壤采自大田耕作层，过筛并掺入适量有机肥，每盆装土14 kg，浇透水后于11月14日手工点播济麦22麦种。出苗后每盆定苗13株，全生育期内定量浇水，正常管理。设5个处理，每处理设3个重复，每盆为1个重复，详细设置见表1。于2018年4月24日(冬小麦扬花初期)喷施病原菌P2孢子悬浮液，并于2018年4月24日(冬小麦扬花初期)和2018年4月29日(扬花盛期)两次喷施拮抗菌Z54菌液。于第二次喷施拮抗菌液后第14和21 d分别调查病情，记录病穗数和病级，并计算防治效果。

表1 小麦赤霉病防治试验设计Table 1 Designation of experiments against wheat Fusarium head blight

依据《小麦赤霉病测报技术规范》[16]调查小麦赤霉病穗数和各穗病级，小麦赤霉病分5级：0级，不发病；1级，病小穗占全穗的1/4以下；2级，病小穗占全穗的1/4～1/2；3级，病小穗占全穗的1/2～3/4；4级，病小穗占全穗的3/4以上。

1.6 Z54防治小麦赤霉病田间试验

1.6.1试验田基本情况 试验地位于江苏省扬州市邗江区郊外农田，为小麦赤霉病常发地块，供试田块基本苗密度均匀，肥力适中，植株生长势基本一致，供试小麦品种为宁麦13，常规肥水管理。

1.6.2试验设计 参照《杀菌剂防治小麦赤霉病》[17]进行大田试验，对扬花期的小麦田采用随机区组法划定小区，每小区20 m2，设4个处理(表1)，每个处理设3个重复。于2018年4月25日(扬花初期)和5月2日分两次施用，每次用药量为750 L·hm-2。

1.6.3试验安全性分析 第一次用药后第3和7 d调查药剂对作物是否有药害，检查植株叶片是否出现斑点、黄化、失绿、枯萎、卷叶、落叶等，植株是否出现缩节、簇生等症状。记录药害的类型和为害症状。

1.6.4试验结果调查 于小麦乳熟期(5月16日和5月23日)分别调查发病情况，每个处理五点取样，每点100穗，记录病穗数和病级，并计算防效。病情指数的分级标准及病指防效的计算方法参照1.5.3。

1.7 数据处理与分析

在Microsoft Excel 2010中对平板抑菌率、病穗率、病情指数、病穗防效、病指防效等进行数据处理，用软件SPSS 16.0进行统计分析，并用单因素方差分析的Duncan法进行多重检验。

2 结果与分析

2.1 生防菌株的分离与筛选

从各地采集的小麦赤霉病病穗上共分离到175株细菌。将菌株按照菌落形态差异进行分类，共分成5组(表2)。从各分组的各采集地中至少选取一株生长速度最快的菌株进行初筛，总共选出32株细菌，供后续试验用。

表2 试验菌株分类及其采集地点Table 2 Classification of tested strains and their collection localities

采用共培养法检测32株细菌菌株发酵液对亚洲镰刀菌P2的拮抗作用，进行拮抗菌株的初筛，结果(图1A)显示，27株对P2均有不同程度的抑制作用，只有5株对P2没有抑制作用。其中，11株对P2菌株的抑制作用明显，含有Z54、Z53、CKJT1、Z3、B263-2、Z31、G11-14-2、Z38、Z6细菌菌液的PDA上P2菌株均未生长，含有G8-5-4、G12-6-1细菌菌液的培养基上P2生长严重受限(图1B)。将11株拮抗细菌菌株分别与亚洲镰刀菌P2菌株对峙培养，进行拮抗细菌菌株的复筛，结果(图1C)显示，Z54、Z53、CKJT1、Z3、G8-5-4、B263-2、Z31、G11-14-2、Z38、Z6、G12-6-1共11个菌株对亚洲镰刀菌P2均有明显抑制作用，与P2对峙培养6 d后，Z54对P2菌丝的抑制率达到70.13%。

显微镜下观察发现，在PDA培养基上生长的亚洲镰刀菌P2菌株的菌丝粗细均匀、纤长，菌丝顶端尖细(图2)。但在对峙平板上，Z54形成的抑菌圈处，亚洲镰刀菌P2菌丝形态异常，菌丝前沿生长明显受到抑制，与CK菌丝相比，该处病原菌菌丝粗细不均匀，分支增加，顶端细胞发育受阻，生长畸形，形似葫芦状(图2)。

注：A:抑制率，不同小写字母表示不同材料间差异在P<0.05水平具有统计学意义；B：共培养；C:对峙培养。Note: A: Inhibition rate, different lowercase letters indicate statistically significant differences between different materials at P<0.05 level; B: Co-culture; C: Dual culture.图1 拮抗细菌对亚洲镰刀菌P2的拮抗作用Fig.1 Antifungal activities of antagonistic bacteria against P2 strain of F. asiaticum

图2 不同处理的亚洲镰刀菌P2菌丝前端形态Fig.2 Morphology of P2 strain of F. asiaticum in different treatments

2.2 拮抗菌Z54的形态学鉴定

拮抗菌Z54在LB平板上生长的菌落呈白色，不规则圆形隆起，不透明，后期菌落呈奶黄色，菌落表面有褶皱，中间凹陷，边缘粗糙(图3)。显微镜油镜观察，发现菌体呈短杆状。过夜培养16 h只有极少数菌体开始产芽胞，培养72 h后，部分菌体产芽胞(图3)。

图3 拮抗菌Z54菌落形态和菌体形态Fig.3 Colony morphology and microscopic morphology of Z54

2.3 高活性拮抗菌的基因序列分析与系统发育树的构建

对菌株的16S rDNA保守序列测序结果进行相关分析，并进行16S rDNA序列的同源性比较，结果显示拮抗菌CKJT1、Z3、Z6、Z31、Z38、Z53、Z54与B.subtilis同源性最高，为98%；拮抗菌G8-5-4、G11-14-2、B263-2与Enterobacterludwigii同源性最高，为100%；拮抗菌G12-6-1与Sphingobacteriumfaecium同源性最高，为99%。

由16S rDNA基因的系统发育树(图4)可知，拮抗菌G8-5-4、G11-14-2、B263-2与E.ludwigii亲缘关系最近，相似性为100%，将其鉴定为E.ludwigii；拮抗菌G12-6-1与S.faecium亲缘关系最近，相似性为99%，将其鉴定为S.faecium。7个拮抗菌CKJT1、Z3、Z6、Z31、Z38、Z53、Z54与B.subtilis亲缘关系最近，相似性98%，初步鉴定为B.subtilis。gyrB基因是蛋白编码基因的典型代表，不会发生频繁的水平转移，在不同蛋白及蛋白的不同位点，其氨基酸替代率也不同，这就使得gyrB基因序列在鉴定芽胞杆菌近缘种方面，比16S rDNA具有更高的分辨率。对7株芽胞杆菌的gyrB基因构建系统发育树，结果(图4)显示，7个菌株与B.subtilis亲缘关系最近，有100%的相似性，因此将其鉴定为B.subtilis。

注：图中加粗黑体菌株表示本研究中分离并鉴定的菌株。Note: Strains in bold were isolated and identified in present research.图4 基于16S rDNA和gyrB序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic trees based on 16S rDNA and gyrB sequence

2.4 拮抗菌Z54盆栽防治小麦赤霉病效果

从盆栽小麦接种亚洲镰刀菌P2和拮抗菌Z54后结果(表3)可知，随着处理时间的延长，各处理的病穗率和病情指数均有不同程度的增加。接种后第14 d，PCK2的病穗率达68.00%，PCK3的病穗率为17.32%，PT1和PT2处理的病穗率为19.26%、19.84%，比PCK2的病穗率降低48.74%、48.16%；病穗防效达到71.68%、70.82%，比PCK3低2.85%、3.71%。PT1和PT2的病情指数为9.63%、9.92%，比PCK2低29.77%、29.48%；病指防效达到75.56%、74.82%，比PCK3低4.46%、5.2%。接种后第21 d，PCK2的病穗率达84.80%，PCK3的病穗率为25.20%，PT1和PT2的病穗率为25.93%、26.19%，分别比PCK2的病穗率降低58.87%、58.61%，病穗防效达到69.43%、69.12%，分别比PCK3低0.86%、1.17%。PT1和PT2的病情指数分别为13.89%、14.29%，分别比PCK2低50.91%、50.51%，病指防效达到78.57%、77.95%，比PCK3低2.29%、2.91%。上述结果说明，拮抗菌Z54发酵液和菌体对小麦赤霉病原菌P2均具有较好的生防效果，可以降低赤霉病的发病率。

表3 Z54防治小麦赤霉病的盆栽试验效果Table 3 Pot experiment results of Z54 strain against wheat Fusarium head blight

2.5 生防菌Z54的田间防治效果

两次生防菌使用之后，发现各处理区小麦长势正常，与清水对照区基本一致，小麦无明显的药害症状。说明生防菌和药剂未对小麦的生长产生不良影响，比较安全。

从表4可以看出，处理后14 d，FT1和FT2处理的病穗率和病情指数差异均不显著(P>0.05,P>0.01)，但均与FCK1差异显著(P<0.05，P<0.01)；FT1、FT2和FCK1的病穗率分别为1.20%、1.13%、3.80%，病情指数分别为0.33%、0.32%、1.02%。FT1和FT2的病穗防效和病指防效在P<0.05和P<0.01水平均差异显著，FT2均优于FT1，且与FCK2均差异显著(P<0.05，P<0.01)；FT1、FT2和FCK2的病穗防效分别为68.42%、70.18%、78.95%，病指防效分别为67.21%、68.85%、80.33%。处理21 d后，FT1、FT2和FCK2处理之间病穗率和病情指数均差异不显著(P>0.01)，均与FCK1差异显著；处理FT1和FT2之间无显著性差异，但与FCK2和FCK1在P<0.05水平差异显著，FT1、FT2、FCK2和FCK1的病穗率分别为1.33%、1.27%、1.00%、4.87%，病情指数分别为0.40%、0.37%、0.27%、1.52%。FT1、FT2 的病穗防效和病指防效均与FCK2在P<0.05和P<0.01水平差异显著，FT1、FT2和FCK2的病穗防效分别为72.60%、73.97%、79.45%，病指防效分别为73.63%、75.82%、82.42%。

综上，随着调查时间的延长，FT1、FT2和FCK2的防治效果均有不同程度的提高，其中FCK2的病穗防效和病指防效最好，FT2效果其次，FT1效果较差，三者在P<0.05和P<0.01水平均差异显著。氰烯菌酯是目前大田中防治小麦赤霉病效果最好的化学药剂。14 d时，Z54菌体和发酵液处理的病穗防效较氰烯菌酯处理低10.53%、8.77%，病指防效低13.12%、11.48%；21 d时，Z54菌体和发酵液处理的病穗防效较氰烯菌酯处理低6.85%、5.48%，病指防效低8.79%、6.60%。

表4 Z54防治小麦赤霉病的田间试验效果Table 4 Field experiment results of Z54 strain against wheat Fusarium head blight

3 讨论

小麦赤霉病的生物防治研究已有一些报道，但尚未见到专门针对亚洲镰刀菌的生防研究。Zhang等[1]研究发现亚洲镰刀菌主要产生3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-ADON)类毒素，而禾谷镰刀菌只产生15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-ADON)类毒素。Ward等[18]研究发现，与产生15-ADON毒素的镰刀菌群体相比，产生3-ADON的镰刀菌群体能产生更多的毒素，表现出更强的繁殖力和更快的生长速率。尽管小麦赤霉病的种群组成和毒素化学型不是完全一一对应的，但亚洲镰刀菌的流行危害以及产生的毒素应引起更多重视。本研究以亚洲镰刀菌为防治对象，筛选出具有高拮抗活性的Z54菌株，经分子生物学鉴定结合形态学分析，将该菌株鉴定为枯草芽胞杆菌。共培养和平板对峙试验表明，Z54菌株能显著抑制亚洲镰刀菌菌丝的生长。盆栽试验表明，Z54菌株的菌体与菌株发酵液对亚洲镰刀菌的防效分别为78.57%和77.95%；田间小区试验显示，菌体与菌株发酵液对小麦赤霉病的防效分别为73.63%和75.82%。说明Z54菌株的菌体和菌株发酵液对亚洲镰刀菌的防治效果较好，具有良好的应用前景。

在前期关于小麦赤霉病生物防治的研究中，已有枯草芽胞杆菌作为拮抗菌的报道。余桂容等[19]从小麦叶片和穗部分离筛选出两株枯草芽胞杆菌B4、B6，对禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病防效均能达到68%以上。刘伟成等[20]从小麦植株上分离筛选到8株拮抗性芽胞杆菌，有7株是枯草芽胞杆菌，其中抑菌活性最强的菌株B08对禾谷镰刀菌的防治效果达到65%以上。本研究中，枯草芽胞杆菌Z54对亚洲镰刀菌引起的小麦赤霉病防效达到69%以上，与上述研究的防效相近。田间小区试验结果显示，Z54发酵液处理对小麦赤霉病的防效优于菌体处理，可能是由于发酵液中产生的某些抑菌代谢产物也具有抑菌作用。因此，枯草芽胞杆菌Z54可作为小麦赤霉病防治的优良生防菌资源。然而，枯草芽胞杆菌Z54拮抗禾谷镰刀菌的作用机制，仍然不清楚，需要进一步研究。

多菌灵曾经是防治小麦赤霉病应用最广泛的化学药剂，但是由于长期使用导致病原菌抗药性增加，多菌灵对小麦赤霉病的防治效果变差。氰烯菌酯是目前生产上防治小麦赤霉病效果较好的化学药剂之一，尽管生防菌Z54的防治效果与其相比稍差，但是从减少化学农药使用、减缓病原菌抗药性产生的角度出发，生物防治是更加理想的选择。生防菌Z54属于芽胞杆菌，繁殖力强，抗逆性强，对环境的适应性强，易于定殖。因此，利用拮抗效果好的芽胞杆菌菌剂对小麦赤霉病进行生物防治，对持续控制病害流行、保证小麦的优质高产稳产具有重要意义。