王科智,许祺欣,苏仁伟 (华南农业大学 兽医学院,广东 广州510000)

子宫腺体是雌性哺乳动物子宫的重要组成部分,腺体以及其分泌物对妊娠的建立和维持是十分重要的[1]。包括畜牧动物猪、牛、羊和人以及啮齿类在内的多种哺乳动物中,子宫腺体都被证明可以合成并分泌多种酶类、生长因子、细胞因子、淋巴因子、激素、转运蛋白以及其他一些物质,这些物质为着床前胚胎、胎儿以及胎盘提供营养物质以支持其着床,妊娠识别以及生长发育[2]。在妊娠期间,受来自卵巢和胎盘的激素的时空性调控,腺体会发生增生和肥大[3-4],分泌量增加,并为整个妊娠期间胎儿的发育提供营养物质。人怀孕的前3个月,由于胎盘发育不完全,胎儿的营养供给主要以这种组织营养为主,在后期胎盘发育完全以后才转为以血液营养为主。而在其他畜牧动物特别是猪、马等胚胎着床方式为表面着床的动物中,由子宫腺体带来的组织性营养贯穿其整个妊娠过程,为胎儿的发育提供营养支持[5]。研究表明,在多种哺乳动物中,因各种因素导致子宫腺体缺失的雌性个体都是不孕的[6-8]。

大部分雌性哺乳动物在刚出生的时候子宫是处于未发育完全的状态,仅由数层间充质细胞和单层腔上皮细胞组成,此时的子宫内不含有任何的腺体。根据物种的不同,子宫内的腺体发育一般持续一到两周的时间,在此期间部分子宫腔上皮增殖分化,向基质迁移,最终形成腺体,该过程称之为子宫腺体的发生。以小鼠为例：在出生后第5天(postnatal day 5,PND5)左右,子宫内膜腔上皮在部分位点开始内陷到子宫间充质中,直到PND7,才能在组织学上分辨出子宫腺芽的存在,腺体从PND10左右开始向子宫内膜基质中扩展,直到PND15基本发育完成[8]。在山羊和小鼠等多种哺乳动物,给新生雌性幼崽连续皮下注射一定剂量的孕酮(P4),可导致其子宫内腺体发生障碍从而造成成年动物子宫腺体的缺失,进而导致雌性动物不孕[8]。然而,P4导致小鼠子宫腺体缺失的机制仍不是很清楚,目前已经证明与该过程有关的只有Wnt信号通路[9]。

转化生长因子-β(transforming growth factor β,Tgfβ)超家族成员在卵泡发育、排卵、卵母细胞-卵丘细胞交流、子宫蜕膜化以及胚胎发育和机体成熟过程中参与了很多细胞分化过程并起到了决定性的作用[10-12]。该超家族的配体包括Tgfβs、activins和骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,Bmps),这些配体与它们的膜结合Ⅰ型和Ⅱ型受体结合,形成一个复杂的结合物进而发挥作用[13]。其中Tgfβ信号通路包括配体Tgfβs、受体Tgfβrs、转录因子Smads以及下游靶基因[12]。在小鼠中,能够与Tgfβ结合的受体有3种：Tgfβr1、Tgfβr2和Tgfβr3,分别由Tgfbr1-3基因编码。Tgfβr2可以直接与配体结合,Tgfβr1 只 能 与 结 合 在Tgfβr2 上 的 配 体 结 合,Tgfβr3则是Tgfβ的共同受体,能够作为Tgfβ储存库帮助Tgfβs与Tgfβr1和Tgfβr2结合。有研究表明,在新生小鼠子宫特异性过激活Tgfβr1能够抑制子宫腺体的发育并影响Wnt信号通路的表达[14-15]。因此,我们假设Tgfβ信号通路可能参与了P4注射导致小鼠子宫腺体缺失的过程。为了验证这一假设,收集经P4处理过的新生仔鼠子宫上皮细胞,检测Tgfb信号通路受体基因Tgfbr1、Tgfbr2、Tgfbr3以及下游靶基因的m RNA 表达水平,并使用Tgfβ信号通路抑制剂LY364947部分挽救了P4处理组小鼠子宫腺体的发生。

1 材料与方法

1.1 实验动物所使用到的孕鼠为C57BL/6J品系,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,饲养于华南农业大学实验动物中心,室内温度22～24℃,相对湿度60%～70%,光照和黑暗时间各12 h。孕鼠分娩出仔鼠当天记为出生后第1天(PND1)。

P4注射：试验分对照组和试验组,每组各3只,试验组在PND2～PND6和PND2～PND10每天皮下注射P4(Sigma,按体质量50 ng/g),对照组皮下注射等体积的芝麻油。于PND7和PND15取材仔鼠子宫,取材时将仔鼠断头处死,取出子宫后剔除系膜以备后续试验检测。

P4、Tgfβ受体抑制剂注射：试验分为对照组和试验组,对照组4只小鼠,试验组5只小鼠。对照组在PND2～PND10每天颈部皮下注射P4(按体质量50 ng/g)和腹部皮下注射5%DMSO(生理盐水配制),试验组在PND2～PND10每天皮下注射P4(按体质量50 ng/g)和腹部皮下注射能够抑制Ⅰ型和Ⅱ型Tgfβ受体的抑制剂(Selleck,LY364947,按体质量1μg/g),于PND15取材并包埋切片。

1.2 子宫内膜上皮细的消化和分离消化体系配制如表1,将清洗干净的子宫加入消化体系内,4℃消化1.5～2.0 h,每隔0.5 h将离心管上下颠倒5～10次。消化完成后,将子宫转移至10% FBS中终止消化,然后用1×PBS清洗3次。

表1 消化体系配方

在解剖镜下,用镊子轻轻固定住子宫一端,在毛细管中吸入一定体积的液体；将毛细管尖端缓慢插入镊子固定好的子宫一端内大概3 mm,将子宫内膜腔上皮较为完整的冲出来；在1×PBS中洗干净后,于倒置显微镜下观察、拍照。

1.3 免疫荧光观察将分离出来的子宫上皮细胞在培养液中轻轻吹散,接种于放置了盖玻片的24孔板内,放入37℃、5% CO2培养箱中培养；待形成贴壁的单层细胞后,去除培养液,用4%多聚甲醛室温固定20 min；用1×PBS 洗3 遍,每遍5 min；用0.1% Tween-20室温处理20 min；1×PBS洗3遍,每遍5 min；用5%驴血清37℃封闭1 h；孵育一抗,4℃过夜(Vimentin,1∶100；Cytokeratin18,1∶100)；去除一抗,1×PBS洗3遍,每遍5 min；二抗37℃孵育30 min；1×PBS洗3遍,用含有DAPI的封片剂封片,使用激光共聚焦荧光显微镜(Leica TCS SP8)观察并拍照。

1.4 HE 染色与免疫组织化学检测于PND15取材小鼠子宫,用4%多聚甲醛固定过夜,包埋后进行石蜡切片(5μm),脱蜡后进行HE 染色。10%马血清封闭后与Foxa2 抗体(Abcam,1∶100)孵育过夜,然后进行酶标二抗孵育和DAB 染色,拍照并统计每个切片上的Foxa2阳性表达的腺体数量,每只小鼠子宫统计10～20片切片。

1.5 总RNA提取、反转录和Real-time PCR将分离的上皮转移入无RNA 酶离心管中,使用TRIzol法提取总RNA,用NanoDrop(NanoDrop 2000c)测量RNA 浓度。使用PrimeScriot RT Master Mix反转录试剂盒进行反转录：50℃15 min,85℃5 s,得到cDNA。

使用Ta KaRa SYBR Premix Ex Taq kit试剂盒,采用BIORAD-CFX96TMReal-time System 进行。PCR 反应条件：95℃10 s；95℃5 s,60℃34 s,重复40个循环。使用Rpl19作为内参,检测目的基因m RNA 水平的表达。所有引物由上海生工生物科技有限公司合成,引物如表2所示。

表2 Real-time PCR 引物序列

1.6 数据分析根据Real-time PCR 系统软件导出的相应基因的Ct值,按照ΔΔCt法计算：ΔΔCt＝(试验组目的基因Ct值－试验组内参基因Ct值)/(对照组目的基因Ct值－对照组内参基因Ct值),试验处理组与对照组中靶基因相对表达的差异倍数计算公式：N(处理组/对照组)＝2－ΔΔCt。

根据Foxa2染色结果,统计每张切片上的腺体数量,计算每只小鼠每片组织切片上的平均腺体数量。试验结果使用GraphPad Prism6 软件进行ttest统计分析,取P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 子宫上皮分离及纯度检测试验首先分离PND10子宫腔上皮,结果得到一条结构基本完整的子宫上皮。其中对照组的子宫上皮存在很多小的突起,为子宫腺芽(图1a),而P4处理组的小鼠子宫腔上皮表面很光滑,没有腺芽的存在(图1b),说明P4处理确实可以导致子宫腺体发生障碍。

为了证明分离出来的子宫上皮细胞不含有间充质细胞,利用免疫荧光法检测对照组上皮中相关特异性标志蛋白的表达。如图1c所示,在分离的上皮细胞中没有检测到间充质细胞特异性表达的Vimentin,而几乎所有的细胞都表达上皮特异性表达的标志分子Cytokeratin18(图1d)。以上结果表明,本研究中分离出的子宫内膜上皮细胞纯度极高,没有间充质细胞的污染。

图1 子宫内膜上皮纯度检测 a.注油组子宫腔上皮(×5)；b.注P4组子宫腔上皮(×5)；c.Vimentin染色；d.Cytokeratin18染色(Bar＝100μm)

2.2 P4处理上调子宫上皮中Tgfbrs及靶基因mRNA的表达PND7是小鼠子宫腺体发育出芽的关键时期,因此检测这一时期子宫上皮中Tgfβ的3种受体基因Tgfbr1、Tgfbr2和Tgfbr3的表达是否受到P4的调节。如图2所示,与注油的对照相比,注射P4的子宫上皮细胞中Tgfbr1 m RNA 表达水平没有明显变化,而Tgfbr2和Tgfbr3 m RNA 表达水平在P4的作用下有所上调。

为了检测上调的Tgfβ 受体表达是否导致了Tgfβ信号通路的激活,还检测了Tgfβ信号通路的下游靶基因Serpine1、Ctgf和Mmp9的表达。结果显示,P4处理后3个靶基因的表达都有上调,其中Ctgf和Mmp9的上调表达具有统计学差异(图2。这些结果表明,在P4导致的新生小鼠子宫腺体缺失过程中,Tgfβ信号通路被激活,可能在这一过程中介导了P4的作用。

图2 PND7子宫上皮细胞中Tgfbrs以及下游靶基因mRNA 表达水平 ∗表示P＜0.05

2.3 抑制Tgfβ受体能够挽救P4处理导致的腺体缺失为了进一步确定Tgfβrs在P4处理导致子宫腺体缺失的过程中所发挥的作用,使用小分子抑制剂LY364947对Tgfβ进行抑制。Y364947 可以同时对Tgfβr1 和Tgfβr2 的功能进行抑制。利用P4和LY364947同时处理仔鼠,并在PND15 检测抑制Tgfβ信号通路是否能够挽救P4处理导致的子宫腺体缺失。结果如图3所示：在PND15,注油组子宫中有数量较多的腺体(图3a),而注P4组子宫中没有发现腺体的存在(图3b)；注射P4和DMSO 组仔鼠子宫中基本没有腺体的存在(图3c),而注射P4和Tgfβ受体抑制剂组仔鼠子宫中出现了部分腺体(图3d)。

为了进一步精确计数子宫腺体的数量,利用免疫组化技术检测腺体的标志性分子Foxa2的表达。结果如图4所示：在注射P4和DMSO 的对照组中只有25%小鼠的子宫中出现Foxa2阳性染色,而注射P4和抑制剂组的试验组中有80%小鼠的子宫中发现了腺体的存在(图4a～c)。进一步的统计发现,试验组每张切片上的腺体数量明显高于对照组每张切片上的腺体数量(图4d)。这些结果表明通过抑制Tgfβ信号通路能够在一定程度上挽救P4介导的子宫腺体缺失。

图3 子宫上皮HE染色 a.注油组小鼠PND15子宫；b.注P4组小鼠PND15子宫；c.注P4和DMSO 组PND15子宫；d.注P4和抑制剂组PND15子宫。Bar＝100μm

图4 Foxa2免疫组化以及腺体数量统计 a.注P4和DMSO 组PND15子宫；b.注P4和抑制剂组PND15子宫；c.试验组和对照组各自含有腺体的小鼠数量所占小鼠总数的百分比；d.试验组和对照组每张切片上的腺体数量比较(Bar＝100μm；∗表示P＜0.05)

3 讨论

雌性哺乳动物的子宫腺体及其分泌物对妊娠的建立和维持十分重要[1],子宫腺体及其功能的异常可影响着床前胚胎发育、胚胎着床以及胎儿和胎盘生长发育并最终影响妊娠结局[2]。在灵长动物特别是人类女性中,每次月经过后子宫内膜都会经历一次修复和重建的过程,该过程需要重建全部的腔上皮和部分的腺上皮,如果重建出现问题可能会影响子宫的接受性,甚至导致不孕[16]。在畜牧生产中,特别是猪等着床方式为表明着床的动物中,胚胎在着床以前在子宫中长时间漂浮而不会与母体子宫建立直接联系；而且由于其胎盘类型的限制,即便着床后的胚胎对组织性营养的需求也高于啮齿类和灵长类,因此深度了解子宫腺的发育可以提高畜牧生产效率[17]。本研究结果证明Tgfβ信号通路在注射P4的初生小鼠子宫上皮中被激活,并且部分介导了P4注射导致的子宫腺体缺失,为子宫腺体发育的分子机制提供了新的证据。

研究结果显示,在PND7这一腺体发育的关键时期,P4可以调节子宫上皮中TgfβⅡ型受体Tgfbr2和Ⅲ型受体Tgfbr3 而不是Ⅰ型受体Tgfbr1 的表达,提示可能是Ⅱ型和Ⅲ型Tgfβ受体而不是Ⅰ型受体介导了新生仔鼠P4注射导致的腺体缺失。其中,Tgfβr3是一种辅助型受体,它的存在可以有效促进Tgfβs与Tgfβr1 以 及Tgfβr2 的 结 合,因 此 推 测Tgfβr2可能在P4介导的子宫腺体缺失中发挥主要作用。但Tgfbr3 m RNA 表达的显著上调也说明Tgfβr3在P4诱导的Tgfβ信号通路的激活中起到重要作用。目前,仅有持续激活Ⅰ型受体Tgfbβ1导致子宫腺体发生障碍的报道[14],而尚未见持续激活Ⅱ型受体Tgfβr2和Ⅲ型受体Tgfβr3的研究报道。这与我们的研究结果看似是矛盾的,但是,Tgfβr1 的持续激活只是一种人为的干预,只有Tgfβr1的表达不受P4的调节并不能否定P4通过调节Tgfβ信号通路来抑制子宫腺体发生的可能。并且,据报道,Tgfβr1只能与结合在Tgfβr2上的配体结合[18],上调的Tgfβr2也可通过辅助Tgfβr1来激活下游信号通路,这与直接过激活Tgfβr1 的结果可能是一致的。

无论是Ⅰ型还是Ⅱ型Tgfβ受体的激活均能通过磷酸化下游的Smad2/3 激活下游基因的表达[14-15]。在本研究中,受P4的影响,Tgfβ下游靶基因Ctgf和Mmp9也受到了明显的上调,说明P4诱导的Tgfβ受体表达上调可以引起该信号通路的激活。小分子抑制剂LY364947可以同时抑制Ⅰ型和Ⅱ型Tgfβ受体的活性,在本研究中发现该抑制剂可以部分挽救由P4导致的PND15 小鼠子宫腺体缺失,进一步证明Tgfβ信号通路介导P4注射引起的小鼠子宫腺体缺失的可能性。但是,这种挽救的能力是极其有限的,P4和LY364947处理组的小鼠子宫腺体数量虽然显著高于P4＋DMSO 组小鼠,但仍远低于未受P4影响的正常PND15仔鼠子宫中腺体数量,表明Tgfβ信号通路仅能部分介导P4在子宫腺体缺失过程中的作用,其他信号通路也可能参与了这个复杂的过程。Wnt信号通路是最早被证明在P4处理的新生小鼠子宫中受到调节的信号通路[9],但Wnt信号通路是否直接介导了P4的作用还缺乏直接的证据。在子宫特异性过激活Tgfβr1的新生小鼠子宫中,Wnt信号通路的表达也受到了影响[14-15]。结合本研究的结果,P4、Tgfβ和Wnt信号通路的相互作用可能在这一过程中发挥了重要的作用。

综上所述,本研究初步证明了Tgfβ信号通路能够介导P4导致的子宫腺体缺失,但只是部分介导了P4的作用,这一过程是否有其他信号通路的参与还需要进一步的研究。此外,P4调节Tgfbrs表达的详细机制也需要进一步的研究和探索。