董 浩,韩 焘,徐 琦,吴方达,刘林青,陈亚娜,原 霖,宋晓晖,王传彬∗ (.中国动物疫病预防控制中心,北京068；.宁德市动物疫病预防控制中心,福建 宁德35000)

布鲁菌病(简称布病)是一种由布鲁菌感染引起的危害严重的人兽共患病,是我国法定扑杀的3种动物疫病(口蹄疫、结核病、布病)之一。布鲁菌的宿主广泛,家畜中主要危害牛、羊、猪等。家畜感染布病主要引起雌性动物的流产和不孕,雄性动物主要引起睾丸肿大。人感染布病主要表现为波浪热、关节疼痛、虚汗、乏力、肝脾肿大等。该病严重威胁着畜牧业的发展和人类的公共卫生安全,每年全世界新发布人感染病病例数超过50万[1]。

病原分离是检测布病的金标准,但是由于分离率低、周期长、生物安全风险高等因素,应用并不广泛。通过血清学方法检测动物血液中的抗体是目前检测布病的主要手段。目前现行的《动物布鲁菌病检测标准》(GB/T18646－2002)中规定的血清学检测方法有虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验和补体结合试验(CFT)等,然而OIE 陆生动物诊断和疫苗手册中,很早就将间接ELISA 和竞争ELISA 方法纳入了国际通用的布病血清学检测方法[2]。根据国家标准委2018年2号公告,新发布的《动物布鲁菌病诊断技术》(GB/T18646－2018)将于2018年9月1日开始实施,首次将间接ELISA 和竞争ELISA 两种方法纳入了国家标准。

间接ELISA 和竞争ELISA 方法是OIE 推荐的布病检测方法,然而,商品化布病ELISA 检测试剂盒的市场被IDEXX、SVANOVA 等国外公司产品长期垄断。2015年以来,我国逐步实现了动物布病高通量和快速检测试剂的国产化。根据国家兽药基础数据库(http：//124.126.15.169：8081/cx/),我国已有获得新兽药证书的ELISA 检测试剂盒3种(布鲁菌竞争ELISA 抗体检测试剂盒、牛布鲁菌间接ELISA 抗体检测试剂盒和布鲁菌cELISA 抗体检测试剂盒)和布鲁菌抗体检测试纸条1种。值得注意的是,目前尚无任何一家国外企业的布病检测试剂盒进行了进口兽药注册。

为了评价国产的间接ELISA、竞争ELISA 和胶体金试纸条方法的敏感性和特异性,我们将这3种检测方法与现行的RBT 以及血清学检测方法金标准CFT 进行了比对。

1 材料与方法

1.1 血清样品牛布病抗体阴阳性血清的样品和用于临床检测的300份奶牛血清样品均采自我国未免疫的奶牛场。

1.2 诊断试剂RBT 抗原、布鲁菌竞争ELISA 抗体检测试剂盒、牛布鲁菌间接ELISA 抗体检测试剂盒、CFT 抗原、标准阳性血清、阴性血清、溶血素和补体均购自中国兽医药品监察所；牛布鲁菌抗体检测卡购自上海快灵生物科技有限公司。

1.3 牛布病抗体阴阳性血清样品的准备选取未免疫的奶牛场,收集牛血清样品,分别用RBT、试管凝集试验和CFT 对样品阴阳性进行判定。最终收集牛布病抗体阳性血清60份,牛布病抗体阴性血清60份用于后续试剂盒比对工作。

1.4 间接ELISA、竞争ELISA 和胶体金试纸条的比较为比较间接ELISA、竞争ELISA 和胶体金试纸条3种方法的敏感性和特异性,采用上述3种检测方法分别对已知阴阳性的阴性血清和阳性血清各60份进行检测。使用不同试剂盒检测血清样品时严格按照商品说明书进行。

1.5 4种血清学检测方法检测临床样品效果的比较

为了比较RBT、间接ELISA、竞争ELISA 和胶体金试纸条的检测效果,分别用4种方法对300份临床样品进行检测,对检测结果不一致的样品采用CFT 进行确诊。RBT 和CFT 按照GB/T18646－2002 进行操作与判定。

2 结果

2.1 对已知阴阳性样品的检测结果为了评价间接ELISA、竞争ELISA 和胶体金试纸条方法的敏感性和特异性,对已知阴阳性的奶牛血清样品各60份进行检测。对60份已知的阳性血清的检测结果如表1所示,间接ELISA、竞争ELISA 试剂盒和胶体金试纸条的敏感性分别为96.67%,100.00%和98.33%；对60份已知的阴性血清的检测结果如表1所示,间接ELISA、竞争ELISA 试剂盒和胶体金试纸条的特异性分别为98.33%,93.33%和93.33%。

2.2 4种血清学检测方法的比对结果分别采用RBT、间接ELISA、竞争ELISA和胶体金试纸条4种检测方法对300份牛的临床血清样品进行检测,结果显示：4种检测方法检测均为阳性的样品为27份,检测均为阴性的样品为210份,整体符合率为79%。

通过CFT 对63份检测结果不一致的样品进行复核试验。结果表明,RBT 与CFT 相比,有61 份样品检测结果不符合,符合率仅为3.17%；间接ELISA 与CFT 相比只有1 份样品检测结果不符合,符合率为98.41%；竞争ELISA 与CFT 相比有8份样品检测结果不符合,符合率为87.30%；胶体金试纸条与CFT 相比有9份样品检测结果不符合,符合率为85.71%(表2)。

表1 3种检测方法的敏感性和特异性比较

表2 CFT 与RBT、间接ELISA、竞争ELISA、胶体金试纸条的符合情况

在现行《动物布鲁菌病检测标准》(GB/T18646－2002)中,RBT 是推荐的动物血清样品初筛的方法,RBT 检测阳性后再通过特异性高的试管凝集试验或CFT 进行确诊。作为一种初筛方法,RBT 具有操作简单、成本低廉等优点,多年来广泛用于家畜布病的检测。但是随着敏感性更高的间接ELISA、竞争ELISA 和胶体金试纸条等检测方法的逐渐成熟,RBT 较低的敏感性也引起了大家的重视。除此之外,由于受到溶血、试验温度、交叉反应以及反应时间过长等因素的干扰,RBT 也会出现相当比例的假阳性[3-5]。

2018年9月1日将开始实施的《动物布鲁菌病检测标准》(GB/T18646－2018)将间接ELISA 和竞争ELISA 写进了检测标准中,为了评价间接ELISA 和竞争ELISA 方法检测动物血清样品的效果,本试验采用临床样品对RBT、间接ELISA 和竞争ELISA 的检测效果进行了评价,并采用血清学检测方法的金标准CFT 进行了确诊。

3 讨论

对120份已知布病抗体阴阳性牛血清的检测结果显示,3种国产布病检测试剂盒的敏感性均高于96%,特异性高于93%,结果比较理想,适用于血清样品中布病抗体的检测。对300份临床样品的检测结果表明间接ELISA、竞争ELISA、胶体金试纸条3种方法与CFT 的符合率均显著高于RBT,RBT不仅存在较高比例的假阴性,同时也存在一定比例的假阳性,RBT 作为一种布病诊断初筛的方法,其敏感性和特异性均存在较高风险。

阳性动物是布病在畜群传播的重要传染源,不论是在家畜引种过程中,还是畜群布病净化的过程中阳性动物的漏检将对同场群的易感动物造成巨大的感染风险。因此,建议在具备ELISA 检测条件的实验室在GB/T18646－2018开始实施后尽快采用ELISA 替换原始的RBT 方法进行布病检测,在不具备ELISA 检测条件的情况下可以选择使用敏感性较高的胶体金试纸条进行布病的初筛,或者增加畜群RBT 检测的频率从而尽可能减少阳性动物的漏检。