朱丹，陈胜凯，谢萍，刘勇，李秋萍，廖瑞敏，刘圆圆*

（1.邵阳学院医学检验学院，湖南邵阳 422000；2.邵阳学院第一附属医院信息科，湖南邵阳 422000）

橘皮中含有的活性黄酮类化合物，具有很高的综合利用价值，尤其是药用价值，如抗癌防癌[1]、抗炎[2]、抑菌、抗氧化[3]、促进脂质与血糖的代谢[4]、保护心血管系统[5]等。最新研究表明，橘黄酮还具有抑制色素的功能，其中黑色素聚集过多会引发一系列美学问题，甚至导致黑色素肿瘤的发生。酪氨酸酶作为黑色素合成过程中的首要限速酶，其活性和含量与黑色素的形成息息相关。酪氨酸酶活性的抑制机制主要有以下3种：（1）黄酮类化合物结构中含有大量的还原性羟基，能够络合酪氨酸酶分子中的Cu2+；（2）有些黄酮类化合物结构与酪氨酸酶的结构相似，均为对位苯酚的结构，可与酪氨酸酶竞争性结合；（3）酪氨酸酶的激活需要氧，黄酮类化合物具有抗氧化性，可以清除过氧自由基，终止自由基链的引发，从而拮抗氧对酪氨酸酶的激活。有研究表明，多羟基黄酮化合物黄芩素诱导体（SD）对酪氨酸酶的抑制作用是竞争性抑制作用；桑叶中黄酮类化合物是通过对氧自由基的清除从而达到抑制酪氨酸酶活性的作用[6]。然而橘皮中黄酮类化合物对酪氨酸酶活性的抑制却鲜有报道。

酪氨酸酶是黑色素合成的重要限速酶，主要催化如下2个反应：催化酪氨酸羟基化形成多巴（单酚氧化酶活性）；氧化多巴生成多巴醌（多酚氧化酶活性）[7]，上述催化过程都需要氧分子才能进行。据报道，目前有些酪氨酸酶抑制剂同时具有抗氧化性。因此，把橘黄酮的抗氧化活性和抑制酪氨酸酶的活性联系在一起进行探究是很有必要的。

酪氨酸酶不但与黑色素的形成有关，食品的褐变、害虫防御体系的形成也都与酪氨酸酶的作用有关，传统的酪氨酸酶抑制剂大多是化学方法合成的，具有一定的毒副作用[6]，因此从自然界寻找高效、安全的酪氨酸酶抑制剂越来越受到人们的重视。本文将首次以邵阳特有果蔬雪峰蜜橘作为橘黄酮的提取原料，初次在体外作用酪氨酸酶，检测抑制率，探究可能的抑制机制，以期为后续抑制黑色素合成的机制研究以及抑制黑色素肿瘤的研究做好前期工作。

1 材料与方法

1.1 仪器

PHSJ-3F型pH计，上海精密科学仪器有限公司；Multiskan FC型酶标仪，赛默飞世尔科技公司；722SP紫外分光光度计，天津市普瑞斯仪器有限公司；DFD-250手提式高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限责任公司；FA2004B电子天平，上海精密科学仪器有限公司；RE52CS旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；GZX-DH电热恒温干燥箱，上海跃进医疗器械厂。

1.2 材料与试剂

雪峰蜜橘，采购于邵阳洞口柑橘园。

蘑菇酪氨酸酶（T3824-25KU）、L-多巴（D9628-5G）购于Sigma；L-抗坏血酸/维生素C（A100143-0100）、芦丁（A610616-0025）等购于上海生工。

1.3 橘皮总黄酮粗提取物的制备

取新鲜成熟的雪峰蜜橘皮，蒸馏水洗净，自然阴干后于60℃热电恒温干燥箱烘干，粉碎机粉碎，颗粒过60目筛，备用。以70%乙醇为提取试剂，物料比为1∶40（g/mL），微波功率600W，提取温度为70℃，提取时间为20 min；取出提取液，过滤后得第1次滤液，滤渣进行第2次浸提，过滤后得滤液，合并两次滤液，于旋转蒸发浓缩至20 mL，得粗提取液（利用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定上述粗提取液得总黄酮浓度为5.02mg/mL），密闭备用[8]。

1.4 橘皮总黄酮粗提取物的生物活性测定

1.4.1 抗氧化性的测定

溶液的配置：用70%乙醇分别配制成0.0 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL浓度的橘皮总黄酮的待测液；用70%乙醇分别配制成 0.5mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5mg/mL浓度的维生素C阳性对照液。

羟基自由基（·OH）清除率的测定：取11支干燥洁净的试管，依次编号0～11，每支试管各加2.0 mL浓度9mmol/L的FeSO4和2.0mL浓度9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，蒸馏水2.0mL，按试管编号依次加入2.0mL不同浓度待测液和2.0mL不同浓度维生素C阳性对照液，各管加入2.0mL浓度为8.8mmol/L的H2O2，启动反应，总反应液37℃保温1.0h，于510nm波长处测定各管吸光度，记录数据，其中0号管为A空白，其余各管为A样品。重复上述实验3次。羟基自由基清除率按照公式1计算。

1.4.2 对酪氨酸酶活性的抑制作用

酪氨酸酶活性的测定[9]：以10mmol/L的L-多巴为底物，现配现用；样品橘黄酮实验浓度为5.0mg/mL；取维生素C纯化试剂配制成5.0mg/mL浓度的阳性对照溶液；磷酸盐缓冲液为空白对照；将购买的蘑菇酪氨酸酶配制成酶活力为110U/mL的酶溶液。

L-多巴溶液、酶溶液、Vc溶液及样品溶液均以50 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH=6.5）配制。按表1组成在96孔版中进行试验，试验的条件为混匀后在25℃预热酶标仪中反应2min，在波长为475nm下测定，记录吸光度A，并按照公式2计算酶活抑制率。重复上述实验3次。

表1 各组反应液组成单位：μL

2 实验结果

2.1 抗氧化性的测定

由图1可知，随着橘黄酮提取物浓度的增加，清除率逐渐增加，在最大样品浓度0.5mg/mL作用下，清除率为56.2%；随着Vc浓度增加，清除率急剧升高，当浓度大于0.3mg/mL后清除率增加缓慢并趋于平稳。对曲线进行分析可知，Vc对羟基自由基的IC50（清除率为50%时的清除剂浓度）约为0.17mg/mL，橘黄酮对羟基自由基的IC50约为0.46mg/mL，表明橘黄酮对羟基自由基有一定的清除效果，具有较强的抗氧化性。

图1 橘黄酮和Vc对羟基自由基的清除率曲线

2.2 对酪氨酸酶活性的抑制作用

由图2可知，Vc和橘黄酮对酪氨酸酶活性的抑制作用随着浓度的增大而增强，Vc对酪氨酸酶的IC50（酶活抑制率为50%时的抑制剂浓度）为0.21mg/mL；橘黄酮对酪氨酸酶的IC50为1.0mg/mL。可见，橘黄酮对酪氨酸酶活性的抑制作用较明显。

3 结论与讨论

通过微波提取法获得橘黄酮的浓度为5.02mg/mL，具有一定的抗氧化性并能抑制酪氨酸酶的活性；在目前实验浓度范围内，随着浓度的增大，作用效果逐渐增强，其中对羟基自由基的IC50为0.46 mg/mL，对酪氨酸酶IC50为0.21mg/mL，但相同浓度下作用效果均低于Vc。酪氨酸酶的激活需要氧，橘黄酮之所以能够抑制酪氨酸酶的活性，极有可能是因为其具有抗氧化性，能终止自由基链的引发，从而拮抗了氧对酪氨酸酶的激活。同时，酪氨酸酶作为黑色素生成过程中首要、唯一的限速酶[10]，绝大部分黑色素抑制剂都可以通过抑制酪氨酸酶的活性来达到抑制效果，因此，橘黄酮具有成为天然黑色素抑制剂的潜在价值。

图2 橘黄酮和VC对酪氨酸酶活性的抑制率曲线

橘黄酮具有较好的体外抗氧化活性和抑制酪氨酶活性的作用，可以作为天然抑制剂，进一步对其进行分离纯化，并对单一黄酮类化合物的结构进行鉴定；同时还可以进行细胞内酪氨酸酶活性的实验以及黑色素肿瘤抑制的动物实验，为橘黄酮在食品、化妆品、药品等领域的进一步开发和利用提供更多的理论依据。