危永芳，董佳瑶，吴沁璇，周碧兰，吴昭全

（长沙医学院药学院，湖南长沙 410219）

急性淋巴细胞白血病是造血系统常见的恶性肿瘤，死亡率高，化疗是其主要的治疗手段之一。顺铂作为第一个被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于肿瘤治疗的铂类药物，通过干扰细胞内DNA的转录和复制，诱导肿瘤细胞凋亡[1]，广泛用于各种肿瘤的治疗。线粒体作为细胞“动力工厂”，其功能的维持对保证细胞正常运转具有重要意义。线粒体是高度动态变化的，能不断地进行分裂和融合，该平衡的维持是保证线粒体正常生理功能的重要基础[2]。线粒体动力相关蛋白（Drp1）作为一种重要的线粒体分裂蛋白，其过表达可促使线粒体分裂增多，导致线粒体呈颗粒状。线粒体是活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的主要来源，Johanna等[3]的研究表明，较高水平的ROS与肿瘤细胞凋亡密切相关。而正常的线粒体形态对于维持细胞内ROS水平具有重要作用。本文通过研究Mdivi-1（一种Drp1抑制剂）对顺铂诱导的L1210细胞ROS产生及细胞凋亡的影响，探讨Drp1介导的线粒体分裂与顺铂抗白血病作用的相关性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

胎牛血清（北京TransGen Biotech公司）；RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）；青霉素/链霉素抗生素（美国Gibco公司）；Mdivi-1（美国Sigma公司）；顺铂（西亚试剂）；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（北京四正柏公司）；活性氧检测试剂盒（美国Sigma公司）。

Guava easyCyte HT 流式细胞仪（美国 Millipore公司）；二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）；SW-CJ-2FD超净化工作台（苏州净化设备有限公司）；Legend micro 17小型台式离心机（美国Thermo公司）；单道移液枪（德国Brand公司）

1.2 细胞培养

L1210细胞株购自武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC），用含1%双抗、10% FBS的RPMI-1640完全培养基，于37℃、5% CO2的培养箱中进行常规培养。

1.3 ROS检测

取对数生长期的L1210细胞，接种于6孔板中，分为对照组、DDP处理组、Mdivi-1+DDP处理组。DDP处理组加入400mg/mL的顺铂，Mdivi-1+DDP处理组加入5μmol/L的Mdivi-1预处理lh，再加入400mg/mL的顺铂，处理48 h；收集细胞，弃上清，用1 μmol/L的DCFH-DA探针1 mL重悬细胞。37℃避光孵育20min，PBS洗两遍，将样品加入圆底96孔板中，上流式细胞仪进行检测。

1.4 细胞凋亡检测

取对数生长期的L1210细胞，接种于6孔板中，按1.3项分组处理细胞48 h后，收集细胞，调节细胞浓度，取 100 μL 细胞悬液，加入 5 μL Annexin V/FITC和10 μL20 μg/mL的PI溶液混匀，避光处理15 min 后，加 400 μLPBS，上流式细胞仪进行分析。

2 结果与分析

2.1 Mdivi-1对顺铂诱导的L1210细胞中ROS的调控

如图1所示，与对照组相比，DDP处理组荧光信号明显增强，提示ROS水平增高，而5μmol/L Mdivi-1预处理可明显降低顺铂诱导的L1210细胞内ROS的产生，但不能完全阻止活性氧的增加。该结果表明，Drp1可通过介导线粒体分裂来调节细胞内ROS水平，该过程可能与顺铂的抗白血病作用有关。

图1 不同处理组细胞内ROS水平

2.2 Mdivi-1对顺铂诱导的L1210细胞凋亡的影响

如图2所示，与对照组相比，DDP处理组细胞凋亡数量明显增多，而5μmol/L的Mdivi-1预处理组，细胞凋亡数量明显减少，说明Mdivi-1对顺铂诱导的细胞凋亡有明显抑制。而Mdivi-1为Drp1的抑制剂，该结果提示Drp1参与了顺铂诱导的L1210细胞凋亡。

图2 Mdivi-1对顺铂诱导的L1210细胞凋亡的影响

3 结论与讨论

顺铂通过与DNA发生交联反应，干扰DNA的转录和复制，诱导肿瘤细胞凋亡，发挥其抗肿瘤作用。线粒体作为细胞能量供应的主要场所，近年来线粒体动力学一直是细胞生物学的研究热点，其运行情况对细胞及机体都至关重要。线粒体分裂和融合虽然不是同时进行，但却高度协调，平衡一旦被打破常常会导致线粒体结构改变和功能障碍，导致ROS产生增加，而高水平的活性氧可诱导细胞凋亡。

本研究显示，顺铂可诱导L1210细胞ROS的产生及细胞凋亡，而Mdivi-1预处理会显著抑制顺铂诱导的ROS产生和细胞凋亡。相关研究发现了Drp1抑制剂Mdivi-1对顺铂诱导的caspases-3活化和细胞凋亡有抑制作用[4]。综合这些研究结果，可以发现Drp1介导的线粒体分裂与顺铂的抗白血病作用息息相关，但其具体分子机制还需进一步研究探索。此外，顺铂耐药性的产生是限制其临床应用的重要原因。有研究显示线粒体动态变化与顺铂耐药性的产生有关[5]，而关于这方面的研究还需要进行深入的探索。