袁冬皓，杨天燕，*，孟 玮，郑 瑶，郑德育

(1.浙江海洋大学 水产学院，浙江 舟山 316022； 2.浙江省海洋水产研究所， 浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室， 农业农村部重点渔场渔业资源科学观测实验站， 浙江 舟山316021)

线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是生物体唯一分布在细胞核外遗传物质，与核DNA有不同的演化起源。由于缺乏遗传重组、群体内变异大、具有较高的突变速率等特点，广泛应用于物种起源、系统进化及遗传背景等领域的研究[8-9]。细胞色素b(cytochromeb，Cytb)基因是目前线粒体基因组中结构和功能研究得最为清楚的蛋白编码功能基因之一。由于其在进化过程中序列变异率相对较高，种间差异较大，且进化速度适中，易用一些通用引物扩增和测序，尤其在物种的个体识别、亲缘关系鉴定和种群遗传关系等研究领域具有较大优势[10-11]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取和PCR扩增

取样品肌肉100 mg左右，采用传统的酚-氯仿法提取基因组DNA[12]，紫外分光光度计检测浓度后，置于-20 ℃保存备用。用于扩增Cytb基因片段的引物序列为L14734(5＇-AACCACCGTTGTTATTCAACT-3＇)和CYTB(5＇-CTCAGAATGACATTTGTCCTCA-3＇)[13]。PCR扩增在美国伯乐PCR扩增仪(Bio-Rad T100)上进行，反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。反应总体积25 μL，其中包含10×Buffer 2.5 μL，dNTP(25 mmol·L-1)2 μL，引物(10 μmol·L-1)各1 μL，全式金TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.25 μL及DNA模板(50 ng)1 μL，去离子水补至25 μL。取2 μL PCR产物与等量的6×DNA Loading buffer混合均匀，经1%的琼脂糖凝胶电泳分离约20 min后，紫外灯观察并拍照记录。选取条带明亮的扩增产物送往上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

1.2.2 数据分析

使用DNASTAR. Lasergene-v7.1软件包[14]截取有效序列片段并进行比对；Dnasp5.0软件[15]检测多态位点和简约信息位点数，计算单倍型数、单倍型多样性和核苷酸多样性；MEGA6.0软件[16]统计碱基组成、碱基替换数，并基于Kimura双参数模型计算种内和种间遗传距离；DAMBE软件[17]进行碱基替代饱和度检验；使用Modeltest 3.7软件[18]对同源序列核苷酸替换最适模型进行筛选，并在此基础上使用PAUP4.0软件[19]中最大似然法(maximum likelihood，ML)构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 序列差异比较

图1 四种属鱼类Cyt b基因片段序列变异位点Fig.1 Nucleotide variation sites of partial Cyt b gene sequences in four Sillago species

表1 四种属鱼类Cyt b基因片段序列的碱基组成频率Table 1 Base frequency compositions of Cyt b gene fragments in four Sillago species %

2.2 遗传多样性分析

2.3 遗传距离及系统发育分析

使用MEGA6软件，基于Kimura 2模型计算得到4种属鱼类的种内不同个体间平均遗传距离分别为斑0.006，亚洲0.007，少鳞0.012，多鳞0.193。不同种间净遗传距离如表3所示，结果显示，斑和亚洲、少鳞间的净遗传距离最大，分别为0.280和0.256；斑与多鳞的净遗传距离最小，为0.157。

使用DAMBE软件进行序列碱基替换饱和度检验，得出ISS

表2 四种属鱼类Cyt b基因片段遗传多样性分析Table 2 Genetic diversity of Cyt b gene fragments in four Sillago species

表3 基于Cyt b基因序列的4种属鱼类种间平均净遗传距离Table 3 Average net genetic distances among four Sillago species based on Cyt b gene

以隶属于鲈形目Perciformes、天竺鲷科Apogonidae、天竺鲷属Apogon的斑纹天竺鲷Apogonmaculatus(GenBank登录号：MG957647)作为外群，在Modeltest软件中基于分级似然比检验(Hierarchical likelihood ratio tests，hLRT)标准，筛选出Cytb基因片段最适核苷酸替代模型为HKY+G(G=0.2417)，使用PAUP软件采用ML法构建4种属鱼类系统发育关系树(图3)。拓扑结果显示，同种不同单倍型之间节点支持率均较高，种间聚类关系呈现为：少鳞和亚洲首先聚类、再与多鳞相聚，最后与斑聚类。从种间聚类关系也可以看出最先分化出的是少鳞和亚洲，其次是多鳞，斑是最晚分化出的鱼类。参考Cytb基因每百万年2%的核苷酸分歧速率[21]，计算得出斑与亚洲的分化时间约为1 400万年前，而少鳞与多鳞的分化时间约为945万年前。整体来看，4种属鱼类种间发生遗传分化的时间均在中新世(Miocene)。

s代表碱基转换，v代表碱基颠换。s meaned the transition; v meaned the transversion.图2 线粒体DNA Cyt b基因碱基替代饱和度分析Fig.2 Saturation plot analysis for the substitutions of mtDNA Cyt b gene

图3 基于ML法构建的单倍型系统发育树Fig.3 ML phylogenetic tree based on haplotypes

3 讨论

薛泰强等[13]基于Cytb基因片段计算得出4种科鱼类(少鳞、多鳞、斑和银S.bassensis)发生分化的时间在1 115～1 425万年前，其中多鳞与少鳞、斑的分歧时间分别为1 140万年和1 115万年。本研究得出多鳞与少鳞的分化时间约945万年、与斑发生分化时间约785万年，二者存在不一致现象，这一方面可能与分析的同源基因序列片段长度不同有关，前者选择了长度为402 bp的序列片段，本研究截取了变异位点分布相对均匀的372 bp序列片段；另一方面与本研究多鳞中可能混有其他种类的鱼(Sihama02)有关，这也是导致种间分化时间与薛泰强等[13]的研究结果存在显著差异的重要原因。为排除统计误差和序列片段差异的影响，作者正在进一步结合其他分子标记技术和解剖学实验以证明其可靠性。但总体来看，几种鱼遗传分歧时间均发生在第三纪的中新世(Miocene)，该结果也印证了分布于印度洋-太平洋的科鱼类在中新世演化发展成为本地种这一结论[28]。