苗永美 童 元 方 达 王宇豪

（安徽科技学院生命与健康科学学院，凤阳 233100）

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）多年生草本植物，也是我国传统珍惜名贵中药材之一。古代医学经典著作中均有记载，铁皮石斛在道家经典《道藏》被誉为“中华九大仙草”之首。铁皮石斛味甘、性微寒，具生津养胃、滋阴清热、润肺益肾、明目强腰、抗肿瘤及提高免疫力等功效［1］。

野生铁皮石斛主要分布在安徽、浙江、福建、云南等地，生于海拔1 600 m 的山地半阴湿的悬崖峭壁处或长满青苔的岩石或树上，喜欢空气湿度大、冷凉环境。铁皮石斛野生资源急剧减少，分别于1987 和1992 年被列为“三级保护品种”和“濒危植物”。利用组织培养技术繁殖种苗后进行人工栽培已在安徽、江苏、浙江等省份开展的如火如荼，但种植铁皮石斛需要模拟原生境高投入，且管理精细。铁皮石斛的离体无性繁殖技术己基本成熟，包括丛苗的繁殖、壮苗生根、原球茎诱导增殖、悬浮培养等；开展的研究主要集中在基本培养基选择、激素优化、有机附加物的添加、活性炭的使用等方面［2］。此外，铁皮石斛成分积累影响因素如光质［3］、培养方法［4］、栽培生长环境［5～6］、内生菌［7～8］等研究也有少量报道。根据作者近年来研究和文献报道，铁皮石斛离体繁殖中仍然存在不定芽诱导率低、植株生长缓慢及促进植株生长和药用成分合成的诱导子研究不够全面等问题。稀土尤其是镧元素在农业生产中最常用，有促进植物生长和代谢产物合成及提高抗逆等功能。研究表明，硝酸镧能促进细茎石斛生长［9］，也能促进铁皮石斛组培苗生长及提高酶活性［10］；铁皮石斛盆苗喷施镧溶液能促进光合、增强抗逆和提高多糖及石斛碱含量［11］。铁皮石斛有效成分主要有多糖、生物碱、菲类化合物、联苄、酚酸、黄酮等［12］。目前，镧在铁皮石斛上的研究相对单一，对产物的种类研究少，对诱导不定芽的影响未见报道。本试验在铁皮石斛不同离体培养阶段，培养基中添加硝酸镧来研究镧对不定芽分化、植株生长及4种代谢产物合成的影响，并进行相关性分析。为后期铁皮石斛细胞规模化培养和高产、高品质栽培奠定理论基础和提供技术服务。

1 材料与方法

1.1 材料

铁皮石斛无菌苗从六安市西山生物技术有限公司购买，在本实验室继代扩繁得到大批组培苗。

1.2 方法

1.2.1 茎段培养的La3+处理

组培苗经继代扩繁后，选取健壮、粗细基本一致的茎条，节处切开，形成两端带节的单茎段，接种在添加硝酸镧的M1（MS+6-BA 0.6 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1）上，使La3+浓度为0、30、50、70、90、110、130、150µmol·L-1，每个处理接种10瓶，每瓶6个茎段，3个月后统计芽数、称芽苗鲜重。

1.2.2 组培苗生长期的La3+处理

选择粗壮、大小基本一致的铁皮石斛从苗称初始鲜重，计Fw1，接入添加硝酸镧的M2（MS+6-BA 0.25 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1）上，使La3+浓度为0、30、50、70、90、110、130、150 µmol·L-1，每处理4瓶。3 个月转接1 次，培养6个月后测叶绿素含量；称鲜重，计Fw2；去根和叶后称鲜重，计Fw3；烘干称干重，计Dw；测干品中多糖、黄酮、总酚和联苄含量。

以上培养基需添加1 g·L-1的活性炭、100 g·L-1土 豆 汁、30 g·L-1蔗 糖、7.5 g·L-1琼 脂 粉，pH=6.5～7.0。光 照 时 间 为12 h·d-1，光 照 强 度 为40µmol·m-2·s-1，温度25±2℃。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 茎段培养相关指标测定

培养3 个月后，计数出芽的茎段数和总芽数，称芽苗的鲜重，根据公式计算出芽率、平均芽数，平均鲜重。

1.3.2 丛苗培养相关指标测定

丛苗培养6 个月后，随机抽取10 株，用SPAD-502PLUS叶绿素仪测量第二叶的SPAD，测3次，均值为该叶片的叶绿素含量；根据公式Fw2/Fw1 计算增重倍数；去叶和根后的鲜条70℃烘15 h 得干品，根据公式Dw/Fw3计算干鲜比。

1.3.3 4种次生代谢产物含量测定

干品研磨，过60 目筛。精密称取样品0.5 g，加30 mL 蒸馏水，90℃水浴提取3 h，按照苗永美等［13］方法得样品多糖液和葡萄糖标准曲线，计算多糖含量（mg·g-1）。样品0.5 g，加30 mL 70%乙醇，70℃加热回流2 h，离心，得上清液，用于黄酮、酚酸和联苄含量的测定。总黄酮含量测定以芦丁为标准品，采用亚硝酸钠—硝酸铝法［14］；总酚酸含量测定以没食子酸为标准品，采用福林酚法［14］；联苄类物质的测定以石斛酚为对照品，按照贾芳等方法［15］用紫外分光光度法测定，得回归方程A=15.511C（mg·mL-1）+0.003 7。活性成分测定每处理做3组平行。

1.4 数据处理

应用Microsoft Excel 2010 和SPSS19.0 进行数据处理与统计分析，采用方差分析和Duncan 新复极差法比较分析稀土镧对铁皮石斛不定芽诱导、组培苗生长和4种成分合成的影响。

2 结果与分析

2.1 不同浓度La3+对茎段出芽及生长的影响

本研究结果（见表1）表明，30～150µmol·L-1的La3+能促进铁皮石斛茎段不定芽的分化及芽苗生长，50µmol·L-1处理上其诱导率最高，显著高于其他处理。芽数这项指标更能综合说明培养效果。La3+浓度在70～90 µmol·L-1时萌发形成的芽较多（2.78～2.83 个），显著高于其他处理。50～90µmol·L-1的La3+促进芽苗生长的效果显著，每瓶鲜重在3.97～4.16 g。茎段培养目的是为了获得更多的芽苗，且长势强壮，根据这一评价标准，认为添加70～90 µmol·L-1的La3+对茎段不定芽诱导和生长效果最好。

2.2 不同浓度La3+对丛苗生长的影响

由图1 看出，随La3+浓度升高，叶绿素含量先逐渐升高后降低，但只有130 µmol·L-1的La3+处理上的植株其叶绿素含量与对照差异显著，含量为70.2 SPAD，比对照提高了9.76%。

不同浓度La3+对铁皮石斛丛苗生长的影响见表2，镧处理下鲜重都有所增加，其中，110～130µmol·L-1La3+处理上植株增重倍数较大，显著高于对照组，其中110 µmol·L-1时增重倍数最高，为15.22，比对照提高了107.64%；110µmol·L-1的La3+最有利于铁皮石斛干物质的积累，干重/鲜重比（以下简称干鲜比）为12.05∶100，对照提高了64.39%。

表1 La3+添加量对茎段离体培养的影响Table 1 Effects of La3+concentration on culture in vitro of stem segments

图1 La3+添加量对植株叶绿素含量的影响Fig.1 Effects of La3+concentration on chlorophyll content

表2 La3+添加量对生物量的影响Table 2 Effects of La3+concentration on plants biomass

2.3 不同浓度La3+对4种代谢产物含量的影响

铁皮石斛干品中4 种代谢产物含量的变化见表3。一定浓度的La3+有利于多糖、黄酮、酚酸和联苄的合成，30～110µmol·L-1La3+处理上其多糖合成能力显著高于对照，110µmol·L-1处理上其多糖含量最高，为98.84 mg·g-1，比对照提高了27.96%；超过130 µmol·L-1时，多糖合成受到显著性的抑制。随La3+浓度的升高，黄酮、酚酸和联苄含量均出现先升高后降低趋势，90µmol·L-1处理上3种成分含量最高，分别为4.31，7.56 和21.01 mg·g-1，比对照显著提高了41.31%，13.35%，73.35%。

表3 La3+添加量对4种代谢产物含量的影响Table 3 Effects of La3+concentrationon the contents of 4 metabolites

2.4 指标的相关分析

由表4可知，叶绿素含量仅与联苄含量的相关性显著，与其他5 个指标相关性不显著；增重倍数与干鲜比、联苄含量之间的相关性都达到显著水平；干鲜比与4种代谢产物含量相关性都不显著；4种产物含量之间相关性显著的有多糖与酚酸、总黄酮与总酚、总黄酮与联苄。根据相关系数的平均值，每项指标与其他6项指标相关性从大到小依次为：联苄含量＞总黄酮含量＞干鲜比＞增重倍数＞多糖含量＞总酚含量＞叶绿素含量。

表4 指标的相关系数Table 4 Correlation coefficient analysis of Indexes

3 讨论

稀土在植物土培、水培或组培等领域都有应用，可以施加到栽培基质中，也可喷施到植株上。植物组织培养过程中添加合适浓度的稀土有促进组培苗分化、生长、愈伤组织形成、再分化及改善品质的作用，已被广泛应用到药用植物离体培养［9～11，16～18］。不同植物所需的稀土种类、浓度和添加时间不尽相同，可能是由于不同植物不同时期的酶活性、细胞分泌等功能受金属离子的影响不同。因此，植物增产、改善品质所需的稀土浓度需不断摸索。作者在进行长期的铁皮石斛组培中发现，石斛苗生长缓慢，继代周期3 个月。前期研究还表明铁皮石斛茎段离体培养中，存在出芽部位要求特殊及外植体易褐化死亡等问题，往往在节处形成芽点而节间极难出芽，采取的措施是在节处切割形成两端带节点的培养物，即便如此，茎段不定芽诱导率仍然很低、芽数少。本试验采用培养基中添加硝酸镧的方式研究La3+的作用，表明70～90µmol·L-1的La3+能显著促进茎段不定芽的形成和生长。130µmol·L-1的La3+能显著提高组培苗叶绿素含量，植株在含110µmol·L-1La3+培养基上生长最好，鲜重增加显著，干物质增加最多，张桂芳研究表明30～40 mg·L-1的硝酸镧能明显提高铁皮石斛组培苗鲜重、株高等，明显降低分蘖数，10～40 mg·L-1的硝酸镧能显著提高叶绿素含量［10］；铁皮石斛盆苗喷施20 mg·L-1的氯化镧后叶绿素含量比对照提高了54.37%［11］；培养基中添加15 mg·L-1硝酸镧处理组的霍山石斛与对照组长势相当，随浓度增加，侧芽高度和增殖倍数受到抑制［19］；当然也有稀土对叶绿素影响不明显的研究报道，如硝酸镧对细茎石斛叶绿素含量影响差异不显著［9］。本研究相关性分析表明叶绿素含量与植株生长量呈正相关，但相关性不显著，说明植株的生长还有可能是因La3+激活了其他生理指标的改变，如有研究指出La3+在促进了铁皮石斛生长的同时，也提高了植株SOD 酶、CAT 酶和根系活力［12］。另有研究指出稀土对紫草的促生也与酶活的提升有关系［18］；但有研究表明La3+是通过与细胞壁的结合以改变细胞的通透性来增加细胞对部分营养离子的吸收，也可能是通过刺激细胞有丝分裂使生物量增加［20～21］。

近年来，镧在提高药用植物次生代谢产物合成方面研究取得了较大进展，如在东北红豆杉细胞生长指数期加入5.8µmol·L-1的镧可促进紫杉醇合成和释放［22］；镧亦能显著促进掌叶大黄毛状根的生物量和蒽醌［23］及人参毛状根皂苷［24］的合成。然而稀土镧对石斛品质的改善研究较少，徐晓燕等用20 mg·L-1的氯化镧喷施铁皮石斛盆苗30 d后，叶和茎秆中可溶性蛋白、脯氨酸、多糖含量和石斛碱含量都比对照有了增加，改善了品质［11］。本试验180 d 的La3+处理改善了铁皮石斛品质，但不同代谢产物的合成需要不同浓度La3+诱导，多糖合成需要的最佳浓度为110 µmol·L-1，黄酮、酚酸和联苄合成的最佳La3+浓度处理是90 µmol·L-1，3种醇提物中，镧对联苄的代谢强度提升幅度最大，黄酮次之，酚酸最小。调控次生代谢产物合成所需镧浓度因植物和产物而异，促进代谢物合成的机理也因代谢产物和途径而异［20～24］。人参皂苷积累中是因La3+促进了皂苷合成中鲨烯合成酶（PgSS）和达玛烯二醇合成酶（PgDDS）的表达，而对β-香树素合成酶（Pg βAS）合成无明显影响［24］；丹参毛状根中，La3+通过直接诱导丹参酮类和酚酸类生物合成代谢关键酶基因来提升其含量［25］；而La3+和Ce3+提高怀槐悬浮细胞中黄酮含量是通过改变细胞的氧化还原状态，进而间接影响苯丙氨酸裂解酶的表达来调控黄酮合成［26］。关于La3+促进铁皮石斛4 种代谢产物合成的机理有待进一步研究。

叶绿素是植物光合作用的主要色素，叶绿素含量越高，光合能力就越强，植物生长也就越好。本研究表明，镧处理的铁皮石斛其生长与叶绿素变化相关性不显著，代谢物中只有联苄与叶绿素相关性显著，说明镧元素是通过改变了其他理化指标而促进了生长及产物合成。根据相关系数的平均值看出联苄和黄酮含量与其他5 个指标受稀土镧调控变化较为一致，且受镧调控影响较大，这两种代谢产物可作为下一步开展镧调控下应用生产或机理研究的主要目标产物。