周 强， 潘清清， 沈 敏， 陈霜霜

（1.重庆市铜梁区中医院检验科，重庆 402560；2.宁波美康生物参考实验室，浙江 宁波 315104）

万古霉素是20世纪50年代从链霉菌中分离得到的糖肽类抗菌药物，其作用机制主要是阻碍细菌细胞壁的合成，改变细菌细胞膜的通透性并影响RNA的合成[1]，对革兰阳性菌有强大的抗菌作用，临床上主要用于治疗革兰阳性菌引起的严重感染[2]，尤其对目前临床治疗较为棘手的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis，MRSE）和肠球菌耐药菌株感染有较好的疗效[3]，且不易产生耐药[4]。由于万古霉素有较高的谷浓度，临床疗程长，所以有一定的耳、肾、肝及神经系统毒性，易出现静脉滴注相关性不良反应等[5]，这些不良反应与血药浓度（30～65 μg/mL），尤其是谷浓度过高有关[6-7]；但如果血药浓度过低，易诱导产生耐药菌，导致治疗失败。因此，临床使用万古霉素时必须严格控制剂量，这就需要进行治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM），以指导个体化用药[8-9]，特别是对于老年患者和肾功能不全患者，需根据TDM结果及时调整用药方案，使血药浓度能维持在一个相对安全的范围内，避免耳、肾功能损伤。美国感染病学会（the Infectious Diseases Society of America，IDSA）、美国卫生系统药师学会（American Society of Health-System Pharmacists，ASHP）和感染病学药师协会（the Society of Infectious Diseases Pharmacists，SIDP）于2011年发布的万古霉素治疗指南及2016年发布的医院获得性肺炎和呼吸机相关肺炎管理指南建议将万古霉素的血清谷浓度控制在10～20 mg/L，至少需要保持在10 mg/L以上[10]，以获得最优的抗感染效果及最小的肾毒性。目前，万古霉素的血药浓度测定方法主要有微生物检测法、酶放大免疫测定法（enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT）、荧光偏振免疫分析法（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）[11]、液相色谱串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[12]和高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[13]等。在这些方法中，FPIA具有全自动化、快速的优点，但其试剂昂贵、专属性差，且检测结果的准确性和重复性不佳，往往导致临床作出错误的判断，给治疗方案的调整带来很大困难[14]。微生物检测法无需特殊的仪器，成本低、操作简单，但用时过长，结果受多种因素影响，且不适用于微量样本的测定。HPLC虽然检测限和精密度没有FPIA高，但特异性强，结果准确，对微量浓度样本更具优势，在国内应用较为普遍[15]。本研究在采用HPLC测定万古霉素血药浓度的方法[16]的基础上，对色谱条件和样本前处理进行优化，以期能建立一种基于超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）技术的快速、准确、灵敏的更适合临床常规TDM的方法，为降低药物检测及治疗成本，指导临床合理使用万古霉素提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2019年4—5月使用万古霉素进行抗感染治疗的患者50例，其中男36例、女14例，年龄50～90岁；所患疾病包括尿毒症、颅内感染、脑梗死后遗症、肺炎、关节炎、膀胱肿瘤、慢性阻塞性肺疾病等。该50例患者的合格血清样本分成 2份，-20 ℃保存待测。

1.2 仪器与试剂

SHIMADZU LC-30A高效液相色谱仪（日本岛津公司）、Phenomenex Kinetex C18色谱柱（2.6 μm，100 mm×2.1 mm）、XS 205DU型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）、Multi Reax漩涡混合器（德国Heidolph公司）、Eppendorf 5427R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）、SevenMulti S40K型pH计（德国梅特勒-托利多有限公司）、Eppendorf移液器（德国Eppendorf AG公司）、PS-10型无油隔膜式真空泵（天津津腾实验设备有限公司）、T-50型溶剂过滤器（天津津腾实验设备有限公司）、容量瓶（日本ASone公司）、Milli-Q超纯水系统（德国Millipore公司）。

盐酸万古霉素标准品（纯度为100.0%，批号为0477708）购自美国Cayman公司。去甲万古霉素标准品（纯度为83.4%，批号为130338-200303）购自中国食品药品检定研究院。磷酸二氢钾（色谱级）和正磷酸（色谱级）均购自美国Thermo Fisher公司。七水合硫酸锌为生物试剂，购自美国Sigma公司。甲醇（质谱级）和乙腈（质谱级）均购自美国Thermo Fisher公司。实验用水为Milli-Q水。

1.3 溶液配制

1.3.1 标准品与内标品配制 精密称取万古霉素标准品24.89 mg（经盐酸万古霉素标准品分子量换算后得出，实际称取盐酸万古霉素标准品25.52 mg）于小烧杯中，加水溶解并多次润洗转移至25 mL容量瓶中稀释混匀，制备995.6 μg/mL万古霉素标准储备液，-20 ℃避光密封保存。分别精密量取不同体积的万古霉素标准储备液，加水溶解并稀释混匀，制备成19.9、49. 8、99.6、199.1、497.8、995.6 μg/mL共6个浓度梯度的万古霉素标准工作液，4 ℃避光密封保存。精密称取去甲万古霉素13.73 mg于小烧杯中，加水溶解并多次润洗转移至25 mL容量瓶中稀释混匀，加水溶解并稀释混匀，制备458.0 μg/mL去甲万古霉素内标工作液，4 ℃避光密封保存。

1.3.2 流动相配制 精密称取磷酸二氢钾3.4 g，加入1 000 mL Milli-Q水中，置于电动搅拌器上，用磷酸调节pH值为2.5，配制成25 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液，经0.45 μm微孔滤膜抽滤。

1.3.3 沉淀剂的配制 精密称取8.63 g七水合硫酸锌，加水溶解并稀释混匀，配制成0.3 mol/L硫酸锌溶液，4 ℃避光密封保存，作为沉淀剂。

1.4 方法

1.4.1 样本前处理 在室温下，准确吸取200 μL血清样本于1.5 mL离心管中，加入458.03 μg/mL内标溶液20 μL，旋涡混合1 min后，加入50 μL蛋白沉淀剂（0.3 mol/L硫酸锌溶液），1 986 r/min水平振荡5 min，随后23 000×g高速离心10 min，取上清液进样。

1.4.2 色谱条件 色谱柱为Phenomenex Kinetex C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），流动相A为25 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH值为2.5），流动相B为乙腈，流速为0.5 mL/min，柱温为40 ℃，检测波长为220 nm；进样量为10 μL，梯度洗脱（0.01→3.00 min，3%B→9%B；3.00→6.50 min，9%B；6.50→6.75 min，9%B→80%B；6.75→10.25 min，80%B；10.25→10.50 min，80%B→3%B；10.50→15 min，3%B）。

1.5 检测方法性能评估

1.5.1 标准曲线与线性评价 取健康人空白血清180 μL，加入不同浓度的万古霉素标准工作液各20 μL，混匀，分别配制成浓度为2.0、5.0、10.0、19.9、49.8、99.6 μg/mL的万古霉素血清样本。按上述样本前处理条件进行处理上样检测，每个浓度平分成3份，每份重复检测3次，取均值。各个浓度的检测偏移＜15%，且r＞0.99可判断为呈线性。

1.5.2 检测限与定量限 采用空白血清加标方式，取适量万古霉素标准液，制备包括定量限预期浓度在内的3个浓度梯度的稀释样本，混匀，分别计算出每个浓度梯度样本的理论值（C1），然后将定量限样本各一式五份进行处理后检测，得到实测值（C2），将同时满足偏移＜20%、变异系数（coefficient of variation，CV）＜20%、信噪比（signal-to-noise ratio，RSN）≥10的浓度值定义为定量限，将RSN=3的计算浓度值定义为检测限。

1.5.3 携带污染率 取180 μL血清，分别加入低、中、高3个浓度的万古霉素标准品工作液20 μL，混匀，配制成3个浓度 [低（L）=2.0 μg/mL，中（M）=19.9 μg/mL，高（H）=79.6 μg/mL）的加标样本，按照上述样本前处理条件进行处理，每份样本一式三份。按L1（低）、L2（低）、M（中）、L3（低）和L1（低）、L2（低）、H（高）、L3（低）的进样顺序来观察携带污染。携带污染率（%）=（L3-L2）/（H-L2）×100%，若携带污染率低于预定标准（1%），则认为在测定该高值及以下时不存在明显的携带污染。

1.5.4 回收率测定 取3个不同浓度的万古霉素标准品，分别添加到空白血清中，混匀，配制成2.0、19.9、79.6 μg/mL的加标样本，分别计算出理论值，然后将各个浓度的加标样本（各5份）进行处理后进样检测，得到实测值，计算加标回收率。回收率在90%～110%为可接受。

1.5.5 精密度测定 取3个不同浓度的万古霉素标准品，分别添加到空白血清中，混匀，配制成2.0、19.9、79.6 μg/mL的混合血清样本，将混合血清样本分装后-70 ℃保存，每个浓度样本每批次各5份，进行样本前处理，连续测定3个批次，每天需要得到3条独立的标准曲线，分别计算批内CV和批间CV。

1.5.6 稳定性 以精密度验证样本中的低浓度血清样本为稳定性研究样本，从以下2个方面评估目标分析物的稳定性：（1）在生物基质中的稳定性，包括室温放置4和8 h的短期稳定性、-20 ℃下反复冻融3次的稳定性；（2）处理后样本的稳定性，包括处理后室温放置的稳定性、处理后自动进样器放置的稳定性。

1.6 患者样本测定

取50例患者的血清样本，分别采用本法和文献报道的经过验证的HPLC[16]进行检测，用相应的标准曲线计算样本中万古霉素的浓度。每个分析批均测定配制的低浓度（2.0 μg/mL）、中浓度（19.9 μg/mL）、高浓度（79.6 μg/mL）质控样本。每个浓度样本各5份，分别计算CV和偏移。

1.7 统计学方法

采用Excel 2013软件和Origin 8.5软件进行统计分析。以经验证的HPLC[16]作为比对方法，评价本法测定结果的准确性。并采用Bland-Altman图形分析法评价2种方法之间的偏移。

2 结果

2.1 方法专属性

在本研究建立的前样本处理方法和色谱分离条件下，测定纯标对照品、空白血清、含药血清加内标的色谱图见图1。万古霉素与去甲万古霉素达到基线分离，且空白血清在万古霉素和去甲万古霉素出峰处无明显杂质峰干扰，峰形良好，内标去甲万古霉素和万古霉素的保留时间分别为4.677 min和5.008 min，检测时间为15 min。同时对比4份不同来源个体的空白血清和其加标血清，4份空白血清在万古霉素和去甲万古霉素出峰处无明显杂质峰干扰，表明不同个体之间的基质对本法的检测结果无干扰，见图2。

2.2 标准曲线与线性评价

UPLC检测血清万古霉素的线性范围为2.0～99.6 μg/mL，线性方程为Y=11.389 3X+0.010 110 7（r=0.999 9）。见图3。

图1 万古霉素专属性色谱图

图2 不同血清基质下的色谱图

图3 UPLC检测血清万古霉素的标准曲线

2.3 检测限与定量限

UPLC检测血清万古霉素的定量限为1.0 μg/mL，检测限为0.1 μg/mL。见表1。

2.4 携带污染率

根据公式计算得中浓度样本（19.9 μg/mL）的平均携带污染率为0.57%，高浓度样本（79.6 μg/mL）的平均携带污染率为0.19%，可认为本法不存在明显的携带污染。见表2。

2.5 加标回收实验

以标准曲线回归方程计算样本浓度，依据实测值与理论值的具体比值计算回收率。加标后3种浓度的血清样本平均回收率分别为104.06%、99.80%、100.19%，见表3。

表1 万古霉素的定量限评估结果

表2 UPLC检测万古霉素的携带污染率 %

表3 UPLC检测万古霉素的加标回收率结果

2.6 精密度评价

采用UPLC定量检测混合血清的万古霉素浓度，低、中、高浓度样本的平均批内CV分别为3.28%、2.21%、2.59%，批间CV分别为5.73%、2.75%、0.82%，见表4。

表4 精密度评价结果

2.7 稳定性

2.7.1 在生物基质中的稳定性 低浓度血清样本在室温[（23±2）℃]放置4和8 h、-20 ℃反复冻融3次的情况下稳定。见表5。

2.7.2 处理后样本的稳定性 样本处理后在室温[（23±2）℃]放置24 h和在自动进样器（温度为8 ℃）放置24 h均非常稳定。见表6。

表5 生物基质样本不同条件放置的稳定性结果

表6 样本处理后不同条件放置的稳定性结果

2.8 方法比对及患者血清样本测定结果的比较

2.8.1 方法比对 2种方法测定质控样本无明显差异，一致性较好。本法测定3个浓度质控样本的CV分别为6.07%、3.14%和2.53%，偏移分别为1.67%、-0.57%和-0.44%；UPLC法测定的3个浓度质控样本的CV分别为6.92%、5.38%和2.92%，偏移分别为1.00%、-0.85%和-0.90%。见表7。2种方法的比较结果见表8。

表7 UPLC和HPLC测定质控样本的结果比较

表8 UPLC和HPLC的比较

2.8.2 患者血清样本测定结果的比较 分别采用UPLC和HPLC测定50例患者的血清万古霉素浓度。以HPLC测定结果为X，UPLC测定结果为Y，2种方法的线性拟合方程为Y=0.970 8X+0.471 3（r=0.991 9），见图4。采用Bland-Altman图形分析法进行分析，2种方法的测定结果相关性良好，平均偏移为0.07%，见图5。

图4 HPLC与UPLC万古霉素测定结果的比较

图5 HPLC与UPLC万古霉素测定结果的Bland-Altman偏移图

3 讨论

近年来，随着不同种类、不同机制抗菌药物的不断面世和临床滥用抗菌药物现象的不断加剧，在过去的10年内，关于万古霉素治疗失败的案例全世界不同地区频频被报道。因此，开发出快速、精准的万古霉素浓度检测方显得尤为重要。本研究在文献报道的HPLC法测定万古霉素血药浓度的基础上，基于UPLC技术建立了一种快速、准确、灵敏的，更适用于临床常规血药浓度监测的方法。

本研究在建立方法时主要考虑检测波长、流动相、蛋白沉淀剂的种类及体积的选择。在波长的选择上，本研究对比了280 nm（《中华人民共和国药典》规定的检测波长）和236 nm（国内大多数文献选择的波长）。除了这2种技术外，还有在210 nm 波长下测定的方法学报道[17]。本研究尝试了不同的波长，综合考虑，在样本中杂质不干扰检测的情况下选择了灵敏度较高的波长（220 nm）作为检测波长。在流动相的选择上，本研究进行了适当改进，采用乙腈为有机相，25 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH值为2.5）为水相，使万古霉素和去甲万古霉素与血清杂质分离完全，且峰形良好，采用梯度洗脱，在万古霉素和内标出峰后提高有机相的比例，尽快将样本中的杂质洗脱出来，保留时间合理，提高了检测效率。在样本前处理方面，本研究以0.3 mol/L硫酸锌（50 μL）为蛋白沉淀剂，对文献报道的浓度和加入量[18]进行微调。在预试验中，我们对7种蛋白沉淀剂及体积进行了对比，分别为甲醇∶乙腈∶6%高氯酸（1∶1∶6）50 μL、100 μL和200 μL，乙腈∶甲醇（1∶1）500 μL，0.3 mol/L硫酸锌50 μL、100 μL和200 μL，0.3 mol/L硫酸锌∶乙腈（1∶1）50 μL、100 μL和200 μL，6%高氯酸200 μL，乙腈∶异丙醇（1∶1）200 μL、10%硫酸锌50 μL和100 μL。从沉淀效果看，除乙腈∶甲醇（1∶1）500 μL、乙腈∶异丙醇（1∶1）200 μL、甲醇∶乙腈∶6%高氯酸（1∶1∶6）50 μL未能得到透明、无色的上清液外，其他相对应体积的蛋白沉淀剂经高速离心后均可得到透明、无色的上清液，其中0.3 mol/L硫酸锌50 μL的沉淀效果最好，操作简单，响应值最高，峰形最佳。

本研究结果显示，UPLC检测血清万古霉素浓度的线性范围为2.0～99.6 μg/mL，定量限和检测限分别为1.0和0.1 μg/mL，灵敏度和线性范围完全能够满足常规检测的要求。精密度评价结果显示，UPLC检测低、中、高浓度样本的平均批内CV分别为3.28%、2.21%、2.59%，批间CV分别为5.73%、2.75%、0.82%；3种浓度（2.0、19.9、79.6 μg/mL）的加标样本平均加标回收率分别为104.06%、99.80%、100.19%，中浓度样本的携带污染率为0.57%，高浓度样本的携带污染率为0.19%。UPLC与HPLC（比对方法）测定质控样本的结果差异不大，一致性较好；测定患者样本的结果相关性良好，平均偏移为0.07%。HPLC采用的是高比例的水相进行等度洗脱，进行样本分析时未用高比例有机相冲洗色谱柱，长时间使用时样本中的脂溶性物质易污染色谱柱。的色谱分析时间（15 min）比文献报道的HPLC（8 min）长，但有利于保护色谱柱，且2个目标峰在6 min内全部出峰，适用于批量检测，文献报道的HPLC[16]2个目标峰在7.5 min内才完全出峰。uPLC前处理采用的是蛋白沉淀，方法快速、简便，而文献报道的HPLC[16]采用的是液液萃取，需要在60 ℃条件下蒸干40 min，操作较为繁杂、耗时。

综上所述，本研究建立的基于UPLC技术测定血清万古霉素的方法具有重现性好、快速、简便、灵敏度高和准确度高等特点，可用于药物代谢动力学研究和TDM，为临床合理、安全用药提供保障。