李铭，王玲，王一男，段雪峰，周顺卿，韩丽英

在女性肿瘤中，宫颈癌位居第四位，在发展中国家更为多见，严重威胁女性健康。2018年，全球死于宫颈癌的女性约有31.1万例，其中85%以上来自发展中国家[1]。随着宫颈癌前筛查和宫颈癌疫苗的普及，近年来宫颈癌特别是宫颈鳞癌的发病率显著下降，但宫颈腺癌所占比例逐年上升，20世纪50年代美国宫颈腺癌占宫颈癌的比例约为5%，现在已达20%～30%[2]。因有约10%的宫颈腺癌未伴随人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染，且宫颈原位腺癌及宫颈腺癌病变多发生在宫颈管内，具有节段性和局灶性，细胞学标本不易采集，相较于鳞状细胞，腺细胞的病理诊断难度较大，故应用现有的HPV检测和细胞学检查对宫颈腺癌进行早期诊断效果欠佳[2-3]。目前临床中宫颈腺癌的治疗方案与鳞癌大致相同，但研究表明相较于宫颈鳞癌，宫颈腺癌的预后不佳[4]。

表观遗传学是一种可遗传性基因调控模式，可在不改变DNA序列的前提下改变基因结构，主要有DNA甲基化、微小RNA（microRNA）调控、组蛋白修饰等。其中DNA甲基化研究最为深入。S-腺苷甲硫氨酸的甲基在DNA甲基转移酶（DNA-methyltransferase，DNMT）的作用下共价结合到胞嘧啶磷酸鸟嘌呤二核苷酸（CpG）的5′-末端，生成5-甲基胞嘧啶，这一过程称为DNA甲基化。CpG岛是5′-端转录调控区中CpG高度集中的区域，CpG占比达60%～70%，多位于启动子区，有些延长到编码区，其甲基化影响基因的转录。虽然表观遗传机制是正常生理发育和基因表达所必需的，但异常的改变与疾病的发生有关，研究发现抑癌基因的甲基化与肿瘤的发生发展密切相关[5]。

1 抑癌基因甲基化与宫颈腺癌

1.1 Wnt/β-catenin通路相关基因 Wnt通路是重要的细胞信号转导通路，主要途径有三条，其中Wnt/β-catenin通路为经典通路，参与多种生物学活动，包括调控基因转录、细胞周期、细胞增殖等。在许多肿瘤中Wnt/β-catenin通路过度激活，促进肿瘤细胞的增殖和转移。一些基因作用于该通路的某些环节，抑制其过度激活，从而抑制肿瘤的发生发展[6]。DNA甲基化是这些基因失活的重要机制。

1.1.1 性别决定区Y框蛋白基因（sex determining region Y-box，SOX） SOX基因家族共有20余个成员，编码一系列转录因子，利用高迁移率族蛋白（HMG）结构域与DNA结合，在胚胎发育、细胞调控方面发挥重要作用。SOX家族成员众多，对肿瘤的影响各有不同。甲基化是其失活的重要因素[7]。SOX1、SOX17可作用于Wnt/β连环蛋白（β-catenin）通路中的βcatenin或T细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF），使Wnt信号不能下传，从而抑制细胞的过度增殖。Chang等[8]在40例宫颈腺癌手术切除组织标本和45例正常宫颈细胞学标本中检测SOX1甲基化水平，OR=32.0（95%CI：12.2～124.4），23 例宫颈腺癌细胞学标本和22例正常宫颈细胞学标本检测SOX1甲基化水平，OR=6.23（95%CI：2.63～15.79），提示 SOX1在宫颈腺癌中甲基化水平较高。Hopman等[9]发现SOX17在宫颈原位腺癌和腺癌中均发生甲基化，并通过免疫组织化学染色证实甲基化导致基因表达沉默；SOX17甲基化似乎与HPV病毒感染类型和病毒整合无关。除Wnt/β-catenin通路外，SOX14还可作用于P53通路，Stanisavljevic等[10]通过体外细胞实验发现，SOX14在宫颈腺癌细胞系HeLa细胞中因甲基化而失活，将SOX14转染入细胞重新表达，增强了P53蛋白的稳定性，P53通路激活，诱导HeLa细胞凋亡。

1.1.2 分泌型卷曲相关蛋白基因（secreted frizzled related proteins，SFRPs） SFRPs基因家族转录表达一组分泌型糖蛋白，其与Wnt通路的受体细胞表面特异性受体卷曲蛋白（frizzled，Fz）具有同源性，通过阻碍Fz蛋白与通路中的蛋白质结合，抑制Wnt信号传导，促使β-catenin分解，以调控下游Wnt靶基因的表达。当SFRPs基因甲基化致使基因表达缺失时，下游的β-catenin在细胞内累积，Wnt通路异常活化，导致细胞过度增殖[11]。van der Meide等[12]的研究中SFRP2的甲基化率在原位腺癌中为45%（5/11），在腺癌中为84%（38/45），在宫颈上皮内瘤变Ⅲ级（CINⅢ）中为 4%（1/27），在鳞癌中为 39%（11/28），SFRP2基因甲基化在宫颈腺癌中更为普遍，随肿瘤进展甲基化程度逐渐增高；该研究者还对45例高危型HPV（hrHPV）阳性而细胞学检查正常的宫颈细胞学标本进行SFRP2甲基化检测并随访5年，其中8例在随访18个月内发生原位腺癌或腺癌，10例在随访5年内发生CIN或鳞癌，这些病例的宫颈细胞学标本中SFRP2均发生了甲基化，而未发病者中只有1例发生甲基化，SFRP2甲基化检测可作为HPV阳性分流的方法。Lin等[13]发现SFRP5在HeLa3rd细胞和CaSki细胞中发生甲基化而表达缺失，将SFRP5转染入细胞，细胞的增殖速度明显下降，侵袭能力也显著降低，说明SFRP5可抑制肿瘤细胞发生发展，DNA甲基化是其失活的主要机制。

1.1.3 DKK3基因 DKK3基因属于Dikkopf家族，位于人染色体11p15.3，其表达的分泌性糖蛋白是Wnt/β-catenin通路的抑制因子，可抑制Wnt信号传导，从而调控细胞的增殖和凋亡。多种肿瘤中发现DKK3表达缺失，大多由其甲基化导致[14]。Zhang等[15]对100例宫颈腺癌进行检测发现有38%发生DKK3甲基化；随着肿瘤的浸润和转移，其甲基化水平逐渐增高；相比于不伴DKK3甲基化的患者，伴DKK3甲基化的患者的总生存期较短。DKK3有希望成为宫颈腺癌诊断和预后的标志物。

1.1.4 结肠腺瘤样息肉病基因（adenomatous polyposis coli，APC） APC是一种广泛表达的多功能蛋白，基因位于人染色体5q22.2，与各种细胞蛋白相互作用，其中研究最为深入的是其诱导β-catenin分解的能力。APC与β-catenin结合使其磷酸化并最终降解，抑制Wnt信号传导，调控细胞的增殖和凋亡[16]。APC的失活有多种机制，包括等位基因丢失、基因突变和启动子甲基化。APC基因甲基化发生在乳腺癌、结直肠癌、肺癌、子宫内膜癌等多种肿瘤中。Song等[17]在宫颈腺癌细胞系HeLa细胞中发现APC基因甲基化，在宫颈鳞癌细胞系SiHa中未发现，提示APC基因甲基化可能对宫颈腺癌影响更大。

1.2 基因表达调控相关基因

1.2.1 锌指蛋白582基因（zinc finger protein 582，ZNF582） 锌指蛋白家族是一组常见的转录因子，其特征是均包含锌指结构，通过与DNA结合以调控靶基因的转录[18]。ZNF582基因在人染色体19q13.43，其生物学功能尚未完全明确，可能参与了DNA损伤修复、细胞周期调控以及和肿瘤相关的各种生物学活动。ZNF582基因在口腔癌、食管鳞癌、结直肠癌和白血病等恶性肿瘤中常发生失活，多由DNA甲基化引起[19]。Wu等[20]在167例宫颈腺癌中发现60%存在ZNF582基因甲基化；ZNF582甲基化阳性者比阴性者的5年无病生存率高；接受了新辅助放化疗的患者，ZNF582甲基化程度逐渐降低；体外实验发现，ZNF582过表达使HeLa细胞对放化疗的耐药性增加，这可能是ZNF582甲基化阳性者预后较好的原因。ZNF582甲基化水平可作为诊断宫颈腺癌的生物标记以及监测放疗和化疗敏感性的工具。

1.2.2 含MYND结构域的锌指蛋白10基因（zinc finger MYND domain-containing protein 10，ZMYND10） ZMYND10又名BLU，位于人染色体3p21.3，研究证实3p21区域包含多个肿瘤抑制基因，如 Ras相关因子（Ras-associated factor 1，RASSF1）和p16等，在肿瘤中常发生基因表达缺失；MYND结构域中包含锌结合基序，这个锌结合基序包括一个蛋白质-蛋白质相互作用的位点，使这些含有MYND结构域的蛋白质具有抑制转录的作用；DNA甲基化导致ZMYND10在多种肿瘤中失活，如鼻咽癌、胃癌等[21]。Lai等[22]在研究中发现ZMYND10在宫颈鳞癌中甲基化率为76%（80/104），在腺癌中甲基化率为 43.5%（10/23）。

1.3 细胞凋亡相关基因

1.3.1 Ras相关区域家族1A基因（Ras-association domain family 1A gene，RASSF1A） 该基因位于人染色体3p21.3，是一种重要的抑癌基因，参与多种途径维持基因稳定、调节细胞周期、抑制肿瘤细胞增殖和迁移。已发现RASSF1A基因甲基化导致其在胃癌、乳腺癌等多种肿瘤中表达下调[23]。研究发现在宫颈癌中RASSF1A普遍发生甲基化，相比于宫颈鳞癌，腺癌中RASSF1A的甲基化率更高，提示其可能与宫颈腺癌关系更为密切；RASSF1A在高级别的宫颈癌或伴随淋巴结转移者甲基化率较高，说明RASSF1A甲基化可能与宫颈癌的进展有关；RASSF1A基因发生甲基化而失活多存在于HPV阴性的宫颈癌中，HPV阳性的宫颈癌中RASSF1A基因则多能正常表达，表明HPV感染与RASSF1A甲基化存在负相关关系，且这两个相互作用的因素可能潜在地决定子宫颈癌亚型的发展，但具体机制还需进一步研究[24]。

1.3.2 死亡相关蛋白激酶1基因（death associated protein kinase 1，DAPK1） 基因位于人染色体9p34.1，属于DAPK家族。DAPK1可参与γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）、p53 等多种细胞因子介导的细胞凋亡过程，正向调控细胞凋亡。甲基化是DAPK1表达下调的一项重要因素，被认为与宫颈癌密切相关[25]。Banzai等[26]研究宫颈病变发现，宫颈腺癌的DAPK1甲基化发生率为63.4%（7/11），CIN3为 31.8%（7/22），原位癌为 28.6%（4/14），Ⅰ期鳞癌为75.9%（22/29），Ⅱ～Ⅳ期鳞癌为84.6%（11/13）。在宫颈鳞癌和宫颈腺癌中DAPK1均发生甲基化，且随着肿瘤的进展水平逐渐增高。

1.4 肿瘤细胞侵袭相关基因 基质金属蛋白酶组织抑制剂 3基因 （tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 3，TIMP3）位于人染色体 22q12.3。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）可分解基底膜和细胞外基质，促进肿瘤新生血管形成，与肿瘤的局部浸润和远处转移密切相关。TIMPs可抑制MMPs活性，维持细胞正常结构和抑制肿瘤细胞增殖和转移。TIMP3是全功能的MMPs抑制剂，它只存在于细胞外基质中，因此对MMPs的作用比其他TIMPs更强。乳腺癌、胃癌中均发现其因甲基化而失活。Kang等[27]发现TIMP3在宫颈鳞癌中甲基化率为 8.1%（5/62），腺癌为 53%（16/30），TIMP3甲基化似乎与腺癌关系更加密切。

1.5 其他基因

1.5.1 TAFA趋化因子家族成员4基因（TAFA chemokine like family member 4，TAFA4）又名FAM19A4，位于人染色体3p14.1。TAFA4编码一种分泌蛋白，为巨噬细胞中甲酰基肽受体1（formyl peptide receptor 1，FPR1）的配体，可促进巨噬细胞和单核细胞的迁移和吞噬，增加活性氧的释放，在免疫中发挥作用[28]。TAFA4的甲基化抑制其转录。Vink等[29]在一项横断面研究中，在全球范围内共收集了519例宫颈癌患者的宫颈细胞标本，包括宫颈鳞癌318例、腺癌123例、腺鳞癌42例及特殊类型癌36例，联合检测TAFA4/miR124-2甲基化率为98.3%，单独检测TAFA4和miR124-2甲基化率分别为94.6%和86.1%，且TAFA4/miR124-2甲基化水平在不同的组织学类型、分期和HPV感染状态均无差异，可作为宫颈癌诊断的标志物。

1.5.2 T淋巴细胞相关蛋白基因（the myelin and lymphocyte-associated protein gene，MAL） 定位于人染色体2q13，MAL基因编码一种高度疏水蛋白，是脂质筏的重要组成部分，参与上皮细胞顶端膜蛋白的极化，在T细胞信号传递、顶端运输、维持细胞膜流动性、构成细胞骨架等多种生物活动中发挥作用。MAL基因启动子甲基化发生于结直肠癌、乳腺癌、头颈鳞癌等多种肿瘤中。Overmeer等[30]检测MAL在宫颈病变中的甲基化率，CIN1中为53%（35/66），CIN3中 81%（52/64），宫颈鳞癌中为 96%（90/94），宫颈腺癌中为96%（27/28）。MAL在宫颈鳞癌和宫颈腺癌中均高度甲基化，且随着病变进展甲基化率逐渐增高，MAL可能是宫颈癌潜在的生物学标记。

2 抑癌基因甲基化在宫颈腺癌中的应用

DNA甲基化是抑癌基因失活的重要机制，是当前宫颈癌早期筛查和诊断的研究热点。现在临床常用的筛查手段对宫颈腺癌的作用有限，主要体现在：①HPV筛查敏感度高，但多数HPV感染可自行消退，且部分腺癌与HPV感染无关；②就病变部位而言，宫颈腺癌发生部位多深入宫颈管内，细胞学检查难采集到标本；③腺细胞的病理诊断难度较大；④部分患者难以接受经阴道采集标本的不适感，依从性较差。目前已发现多种基因DNA甲基化与宫颈腺癌的发生有直接关联。现有的甲基化检测方法，如重亚硫酸氢钠修饰后测序法、实时荧光PCR法等敏感度和特异度均较高[31]。通过对大样本人群的研究，患者的自采样本与医师采集样本的结果无明显差异，患者自采样本可大大提高患者的依从性[32]。肿瘤细胞可向血液内释放DNA，研究发现，宫颈腺癌患者的血液标本和细胞学标本中RASSF1A甲基化水平无明显差异，由此可见，相较于现行的宫颈癌筛查方法，DNA甲基化检测有希望采用抽血等更为方便的手段[24]。DNA甲基化检查有可能成为宫颈癌早期筛查和诊断的重要手段。

DNA甲基化是一个可逆的过程，失活的抑癌基因通过去甲基化可以重新表达，发挥抑癌作用。研究已发现一些物质具有去甲基化的功能。地西他滨可强效地抑制DNMT的活性，不仅可逆转宿主细胞基因的甲基化，还可使HPVE6E7蛋白基因去甲基化[33]。在一项Ⅲ期临床研究中，接受同步放化疗的晚期宫颈癌患者同时应用DNMT抑制剂氢丙嗪和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂丙戊酸钠，与单纯接受同步放化疗的患者相比，其无病生存期有所延长[34]。从植物中提取的天然物质染料木黄酮可有效地抑制HeLa细胞中MGMT和HDAC的活性，使多种抑癌基因恢复表达[35]。姜黄素可抑制HeLa细胞和SiHa细胞中MGMT的活性，逆转维甲酸受体β2（RARβ2）基因甲基化[36]。中药提取的天花粉蛋白可逆转Cascki细胞中半胱天冬酶第二线粒体激活因子（Smac）基因的甲基化，使其恢复对细胞凋亡的调控，并可使肿瘤细胞对化疗药更加敏感[37]。去甲基化可作为宫颈癌治疗的一个新方向，研究者们正在寻找更有针对性、效果更好的药物。多种抑癌基因的甲基化程度随肿瘤分期、淋巴结转移而提高，与肿瘤的发展存在密切关系，如RASSF1A、ZNF582、DKK3等。DNA甲基化也可作为肿瘤治疗预后的标记物。

3 结语与展望

目前，已发现多种抑癌基因在宫颈腺癌中发生甲基化，SFRPs、RASSF1A等基因在宫颈腺癌中的甲基化程度较鳞癌中高，SFRPs、DAPK1等基因在原位腺癌中即发生甲基化，这些基因可作为早期特异性诊断宫颈腺癌的标志物。RASSF1A、DKK3等基因的甲基化水平随宫颈腺癌的进展而升高，DKK3、ZNF582等基因的甲基化与宫颈腺癌的预后密切相关，这些基因可用于宫颈腺癌预后和治疗效果的评估。基因甲基化是一个可逆的过程，通过去甲基化使抑癌基因恢复表达，可有效抑制肿瘤细胞的增殖。但是目前对宫颈腺癌的抑癌基因甲基化研究尚不充分，多为小样本研究或细胞层面研究，且尚未找到特异度和敏感度均较高的基因以供临床应用。针对宫颈腺癌相关抑癌基因及其甲基化的研究，将会为宫颈腺癌的早期诊断和治疗提供新的方向。