陈宏佳 朱应群

长沙市第三医院呼吸危重症医学科410015

肺动脉高压 (pulmonary hypertension,PH)是各种原因引起肺血管阻力增加的疾病或病理生理综合征,最终结局是右心衰竭甚至死亡［1-2］。其定义为:在海平面上,经右心导管检查静息状态时平均肺动脉压≥25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),或运动后平均肺动脉压≥30 mm Hg,同时肺动脉楔压≤15 mm Hg［3］。PH 的发病机制尚无定论,主流认为与炎症激活、肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC)、肺动脉内皮细胞 (pulmonary artery endothelial cell,PAEC)、肺血管成纤维细胞的异常增生、分化、凋亡等密切相关。目前无有效的PH 早期监测指标,且缺乏精准的治疗靶点,临床常规治疗效果差。当务之急是找到能在临床上大力推广的有效的PH 诊疗指标,以改善疾病预后及患者生存质量。

大量研究提示,微小RNA (microRNA,miRNA)可以作为一种上游信号分子调控慢性低氧、炎症、骨形成蛋白Ⅱ型受体 (bone morphogenetic protein type Ⅱreceptor,BMPR2)基因突变、转化生长因子 (transforming growth factor,TGF)/BMP信号通路、Rho激酶系统等PH 致病通 路 的 表 达。 如 miR-21、miR-143/145、miR-17/92、miR-204、miR-130等［4］已证实与PH 关系密切。

1 miRNA

1.1 miRNA 的简介 miRNA 是一类约21～25 nt长的高度进化保守的内源性单链非编码小分子RNA［5］,几乎存在于所有的生物体。首个miRNA 是1993年被发现并命名的lin-4,即Lee等［6］在秀丽隐杆线虫中意外发现的一种长约22 nt、不编码蛋白质、对各种胚胎后期的发育进程起关键调控作用的基因。截至2018年10月,在动植物以及病毒中已发现38 589种miRNA。存在于人体中的miRNA 超过2 500个,虽然只占人类基因的2%,但却调控着约1/3的m RNA。基础实验显示,单个miRNA 可调控上百个m RNA,而特定的m RNA 也可受多种不同miRNA 的联合调控［7］。miRNA 能在转录和翻译层面调控基因的表达,进而调控机体稳态和疾病中的各类细胞变化过程。

1.2 miRNA 的生物合成 miRNA 的生物合成大体上分为3个步骤。 (1)前体生成:位于基因间或内含子区域的miRNA 相关编码基因在细胞核内由RNA 聚合酶Ⅱ或Ⅲ转录为具有poly A 尾和帽子结构的原始转录产物,即初级miRNA,长约成百上千个核苷酸。随后与核酸内切酶Ⅲ-Drosha及辅助因子DGCR8 发生反应,脱去尾巴及帽子,加工成具有茎环结构、约70～90 nt长的前体miRNA。(2)出核转运:结合Ran-GTP 依赖的核质/胞质转运蛋白5,前体miRNA 可以从胞核转移至胞质;被Dicer酶剪切成长约21～25 nt的双链miRNA。 (3)成熟:双链miRNA 解螺旋,一条链降解,保留下的单链即为成熟miRNA,可与RNA 诱导沉默复合体 (RNA-induced silencing complex,RISC)结合形成miRNA-RISC,调控基因转录后修饰。

1.3 miRNA 的作用机制 miRNA-RISC 与靶基因mRNA的互补性决定其作用机制与效果,可分以下3种。(1)促进靶基因的降解:如果miRNA 与靶m RNA 具有很强的互补性 (完全或接近完全互补,植物中多见),该复合物可在互补区特异性地破坏靶m RNA,使其降解,基因不表达。(2)抑制靶基因的翻译:若miRNA 与靶m RNA 的互补性低 (常见,尤其是动物中),则靶mRNA 的翻译受阻,蛋白表达水平改变,起负调控作用。抑制程度与miRNA 结合靶m RNA 的位点数有关,大部分位于3'端非翻译区。(3)结合抑制:同时具备上述2种机制。

1.4 miRNA 的生物学特性 miRNA 有以下几个明显的特征:(1)miRNA 在各类生物的基因组中以基因簇、多拷贝或单拷贝等多种形式存在,其转录不翻译成蛋白质,与其他基因无关。(2)通常来说,长度约为22 nt;3'端能增减几个碱基。(3)miRNA 在物种之间的演变高度保守,在茎部尤其明显,但可在环部出现突变。(4)miRNA 可按5'端基因序列差异分为具有高度组织特异性、时序性和保守性的不同家族。(5)miRNA 的抗降解能力较强,在血浆中大多以与蛋白质结合的形式稳定存在,不易被RNA 酶降解,能在室温下放置1 d或反复冻融8次后相对分子质量保持不变。

2 与PH 相关的miRNA

2.1 miR-21 miR-21是近年来报道较多的一种与PH 密切相关的miRNA。Parikh等［8］使用网络生物学方法鉴定了多种与PH 致病因素包括低氧、炎症、遗传单倍体功能不全、BMPR2基因突变和Rho/Rho激酶信号传导等相关的miRNA,结合体内验证性数据,证实miR-21 在其中作用显著。缺氧和BMPR2可直接上调miR-21在PAEC 内的表达,而miR-21 可反向下调BMPR2。在PH 小鼠中抑制miR-21表达,结果RhoB表达增加,Rho激酶活化,并有PH 加重现象。White等［9］研究显示在缺少miR-21基因的小鼠中肺组织程序性细胞死亡蛋白4 (programmed cell death 4,PDCD4)/caspase-3 (一种半胱氨酸蛋白酶)凋亡通路激活,导致进行性PH 的发生;而miR-21 过表达的PH 小鼠肺组织中的PDCD4 表达降低,并在慢性缺氧和SU5416 (一种抑制血管内皮生长的人工制剂)损伤的情况下可部分抵抗PH 发展。说明miR-21在PH 发病中起保护性作用。

但是有些研究结果与此相矛盾,认为miR-21是PAEC和PASMC的促增殖因子,促进PH 发展。Sarkar等［10］提出,人PASMC中miR-21表达量在低氧 (3%O2)刺激6 h后升高了3倍,在缺氧24 h后仍保持高表达 (2倍),导致靶基因表达抑制,特别是PDCD4、过氧化物酶增殖物激活受 体 α (peroxisome proliferator activated receptor-α,PPARα)、Sprouty2 (由SPRY2基因编码的蛋白)等促凋亡基因表达降低,刺激PASMC 增殖。Iannone等［11］研究显示,低氧诱导的PH 小鼠中,miR-21在内皮细胞中特异性 下 调 二 甲 基 精 氨 酸 二 甲 基 氨 基 水 解 酶 1(dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1,DDAH1),引起内皮功能障碍,进而促进PH 发生;而使用miR-21抑制剂或DDAH1转基因治疗后小鼠肺DDAH1升高,PH 进程阻断。Yang等［12］研究表明,miR-21在缺氧暴露小鼠的肺远端小动脉中表达增加,在低氧暴露前后,抑制miR-21均可抑制缺氧所致的肺血管重构、减少PH 生成。同时,体外细胞培养研究发现［12-13］,miR-21高表达可上调细胞增殖相关的蛋白 (如增殖细胞核抗原、细胞周期蛋白D1 和Bcl-x L),下调抑癌基因PTEN,刺激PASMC增殖。

国内 学 者［14-15］发 现,COPD 合 并PH 患 者 的 血 清 中miR-21含量大幅升高,并与血清N 末端脑钠肽前体含量、平均肺动脉压、肺血管阻力等PH 检测指标呈正相关,提示miR-21在评估PH 病情严重程度方面有诊断价值。

2.2 miR-143/145 miR-143和miR-145是参与调控血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cells,VSMC)表达的2个关键miRNA［4,16］。有研究表明,miR-143/145簇选择性高表达于发育过程中的VSMC,加速细胞分化、抑制增殖。VSMC缺失miR-143 和miR-145,将无法在血管压力升高的刺激下保持可收缩表型［17］。动物实验发现,miR-143/145可以协同靶向转录因子网络,包括Krüppel样因子4 (Krüppel-like factor 4,KLF-4)、KLF-5、心肌素和ELK1 (ETS癌基因家族的成员),以调控肌钙蛋白、平滑肌肌动蛋白和平滑肌22α蛋白的表达水平,从而维持VSMC 的 可 收 缩 表 型,抑 制VSMC 增 生［17-20］。同 时,Albinsson等［16］发现miR-145 可有效控制内膜增生、血管损伤、重塑等病变的发生。

然而,Caruso等［21］通 过PCR 手 段 检 测 出miR-145 在缺氧的野生型PH 小鼠模型、特发性和遗传性PH 患者发生重构的肺血管中表达上调。同时发现,BMPR2突变或缺陷可导致小鼠和PH 患者PASMC 中miR-145 表达增加,进而通过下调靶蛋白ELK1和KLF-4发挥促进PASMC 增殖的作用。提示miR-145参与了BMP的下游通路。此外,对敲除miR-145基因或经抗miR-145干预后的小鼠进行评估,发现收缩期右心室压力得到改善,右心室肥厚程度减轻,血管重塑百分比降低,PH 发展受阻。提示miR-150促进PH 生成,特异性地下调miR-145的表达对低氧性PH的形成具有保护作用。但未发现下调miR-143对PH 有相似的保护作用。国内学者［22］报道,在PH 动物及人体PASMC中,miR-143和miR-145明显上调而ATP 结合盒转运蛋白 A1 (ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)下调。确定ABCA1 是PASMC 中miR-143/145的直接靶标,可部分逆转miR-143/145介导的暴露于低氧的PASMC中细胞增殖和迁移的促进作用;并进一步在体内实验证实,抑制miR-143/145可通过靶向过表达ABCA1来预防低氧诱导的PH 和肺血管重塑。

综上所述,miR-145 可以通过不同的信号通路在PH形成中发挥不同作用,在未来的研究中应着眼于其综合作用的探索并应用于临床。

2.3 miR-17/92 miR-17/92 是一个位于人类染色体上的多 顺 反 子 基 因 簇, 由 miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-20a 和miR-92-1 组 成［23］。miR-17/92 簇最初被认为是最具特征性的致癌miRNA。近年来通过功能基因组学中的基因敲除技术发现它与心肺发育有关,在血管重构中发挥一定作用。

在PAEC 方面,Brock等［24］发现miR-17/92基因簇中的miR-17-5p和miR-20a异位过表达可直接导致内皮细胞中的BMPR2蛋白明显减少,促进内皮细胞增殖。通过刺激实验证实miR-17/92簇受IL-6的调节,而IL-6信号由信号转导和转录激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)介导。研究者进一步探索了敲除STAT3基因能否阻止miR-17/92上调,发现STAT3基因被剔除后,IL-6 介导的miR-17/92 一系列反应消失,但BMPR2可保持不变。

在PASMC方 面,Brock 等［25］在 低 氧 诱 导 的PH 小 鼠及人PASMC 中使用miR-20a拮抗剂,发现BMPR2 水平恢复,血管重塑受阻。Pullamsetti等［26］发现miR-17在PH小鼠中表达上调,特异性miR-17 抑制剂可通过显著上调PASMC中的细胞周期蛋白依赖蛋白激酶抑制剂1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A),大幅降低肺血管阻力和右心室收缩压,干扰肺血管和右心室的重构,改善实验性PH 中的心肺功能。Chen等［27］通过动物及人体外细胞实验发现,PDZ 和LIM 结构域5 (PDZ and LIM domain 5,PDLIM5)是miR-17/92 的直接靶标;敲除miR-17/92 基 因 可 激 活PDLIM5 诱 导 的TGF-β/Smad3(一种信号转导蛋白)通路,使肌钙蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、平滑肌22α蛋白表达增加,PASMC 增殖抑制,阻碍PH 形成。该实验揭示了另一条PH 发生通路,即miR-17/92-PDLIM5-TGF-β/Smad信号通路。

2.4 miR-204 miR-204主要在肺循环中表达并发挥作用,且多数定位在PASMC。已有资料显示,维持PASMC的增生和抗凋亡涉及活化T 细胞核因子 (nuclear factor of activated T cell,NFAT)、蛋白酪氨酸磷酸酶2 (SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2,SHP-2)和STAT3的作用。具体机制如下:首先是STAT3的激活可直接诱导NFAT 胞浆蛋白2抗体的表达,抑制miR-204表达;而低水平miR-204可增加SHP-2水平,激活Src激酶与NFAT;最后激活的Src 激酶又可反过来激活STAT3,形成一个正反馈环路［28-29］。

Courboulin等［28］发现miR-204在临床PH 患者和啮齿动物PH 模型的PASMC 中均明显下调,且下调幅度与病情轻重呈正相关,miR-204过表达可在一定程度上缓解病情。结合miRNA 靶点运算法则及已知的PH 发展过程,证实Src-STAT3-NFAT-miR-204-SHP-2 信号通路的存在。该组研究者还检测了8例PH 患者外周血中miR-204的表达水平,提示较明显的下降,考虑miR-204 有望成为PH外周血诊断标志物,但该结论需在大样本中进一步验证。Pan等［30］发现在PH 大鼠肺组织中给予人工合成的miR-204类似物后,可明显减轻PH 病情。

2.5 miR-130 多项研究表明miR-130在PH 中表达上调,并与 疾 病 严 重 程 度 直 接 相 关［31］。Wu 等［32］研 究 发 现,miR-130a可通过靶向抑制具有抗血管生成作用的生长终止特异性同源盒基因的表达来促进血管生成、平滑肌增殖,有浓度依赖性和时间依赖性的特点。

Brock等［33］通过缺氧诱导PH 的小鼠模型和体外实验证实,miR-130 可通过直接靶向调节CDKN1A 来控制PASMC 增 殖。 用 miR-130 转 染 人 PASMC 会 降 低CDKN1A 的表达,进而显著增加平滑肌的增殖;相反,miR-130拮抗剂可使CDKN1A 的表达恢复。这些数据表明,miR-130在缺氧抑制CDKN1A 中起重要作用,参与PH 心肺重构过程的可能性大。

Bertero等［34］认为在多种肺血管细胞中,miR-130/301簇通过激活共同的转录因子YAP/TAZ诱导血管细胞外基质的重塑和硬化;还可通过PPARγ-ApoE-LRP8轴调节血管活性因子的分泌,调控肺血管收缩。

2.6 其他miRNA 有研究发现［35］在低氧诱导的PH 大鼠模型肺组织中miR-98 表达显著下调,并通过抑制ALK1的表达来减少肺血管增生和胶原沉积。Kang 等［36］发现miR-98在PH 的PAEC 中表达下降,敲除PPARγ基因可靶向增加内皮素1和增殖细胞核抗原的表达,减少miR-98,促进PAEC增殖。另一项［37］纳入116例患者的临床研究提示COPD 继发PH 患者外周血miR-98的表达水平低于健康人群和单纯COPD 患者,认为外周血miR-98有望应用于COPD 继发PH 的早期临床诊断和病情评估。

miR-214在COPD 相 关PH 患 者 的PASMC 中 显 著 上调,并且可以通过靶点CCNL2来促进PASMC 的增殖［38］。另有学者［39］认为miR-214在PASMC中靶向结合重组人缺氧诱导因子1α抑制剂的3'端非翻译区,促进细胞增生。

在野百合碱诱导的PH 大鼠中miR-29a表达大幅度下调,增加miR-29a含量可明显改善肺血管重构［40］。有研究发现［41］,miR-29b可通过抑制靶基因CCND2 和Mcl-1 来使PASMC增殖抑制,加速凋亡;在PH 动物模型中加入miR-29b类似物后,右心室收缩压降低,右心室肥厚程度减轻,肺血管重构表现出现逆转。Yang等［42］在人肺成纤维细胞中发现,miR-29 调控TGF-β1通过PI3K-Akt信号通路介导胶原合成,影响PH 发展。

Zhou等［43］发 现COPD 合 并PH 组 的miR-942 表 达 水平远低于单纯COPD 组,但CCND1 的表达水平却比单纯COPD 组高得多;认为低水平miR-942 通过增强CCND1表达来促进PASMC增殖,从而影响PH 的血管重塑。

Rhodes等［44］对8例PH 患者及8 名健康人的血浆总RNA 进行了微阵列筛选,发现在58个出现差异性表达的miRNA 中,miR-150下调最明显。随后,他们用统计学方法证实miR-150水平可独立预测PH 生存率,miR-150 降低提示PH 预后差。有学者发现,高表达的miR-150可以通过Akt/m TOR 信号通路减少Ki67蛋白的表达来抑制平滑肌增生［45］;也可通过降低缺氧诱导因子1α的表达来减轻缺氧引起的PASMC过度增殖和迁移［46］。

Liu等［47］发现miR-27a在缺氧处理的大鼠和人PAEC中高表达,且通过靶向调节Smad5抑制了BMP信号传导,从而减轻了Id2 介导的内皮-间质转化的2 个关键介质(Snail和Twist)的抑制作用,即miR-27a通过抑制BMP信号传导促进低氧诱导的PH 中的内皮-间质转化。

3 结语与展望

miRNA 作为一个转录后调控基因在人体内数量庞大,可调控约1/3的基因表达。大量国内外研究证明,miRNA与血管平滑肌细胞、内皮细胞及肺血管成纤维细胞的增殖、迁移有着极为密切的关系,可作为一种上游信号分子调控肺血管重塑。但由于PH 发病机制复杂,作用位点众多,不同miRNA 在不同细胞中参与的信号通路不同,且当前研究成果大多取自动物实验及人体外细胞培养,在PH 患者体内的具体靶点及调控机制可能存在差异,尚难以在临床推广应用,需进一步研究。可以预见的是,miRNA 作为新型的PH 诊疗靶点有很广阔的研究前景。通过综合利用各种前沿技术、精准追踪、扩大标本量等方式对miRNA进行更深入的研究,相信会取得喜人成果,为PH 的早期诊断和防治提供新的依据及方向。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突