刘睿超 李乐 王若利 孙金英 王潇 岳红梅

1兰州大学第一临床医学院730000;2兰州大学第一医院呼吸与危重症医学科730000

特发性肺纤维化 (idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种病因不明的慢性致死性肺部疾病［1］。在肺纤维化过程中,正常健康肺组织被明显破坏的肺泡结构和改变的细胞外基质所取代。这些变化导致肺气体交换中断,顺应性降低,最终导致呼吸衰竭和死亡［2］。IPF 的5 年生存率在20%～40%之间,死亡率高于结肠癌、多发性骨髓瘤和膀胱癌等多种恶性肿瘤［3］。目前,IPF 主要的诊断依据为患者的临床症状、体征、高分辨率CT、肺功能、支气管肺泡灌洗甚至是肺穿刺活检。高分辨率CT 在诊断IPF 上有一定的局限性［4］,IPF 临床表现复杂,部分患者CT 表现不典型,其他间质性肺病也可与IPF表现相同或类似。急性加重是IPF患者快速恶化和高死亡率的常见原因［5］。因此,诊断IPF、监测IPF 进展、判断IPF 预后的生物标志物受到了广泛关注［6］。IPF 中许多异常表达的标志物无法透过肺内皮屏障,检测其在血浆中的含量比较困难,因此,检测支气管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid,BALF)有一定价值,因支气管镜为有创性检查,实际应用仍有一定的局限性。本文简要综述BALF中不同生物标志物在IPF的诊断、疾病进展及判断预后中的价值。

1 与诊断有关的生物标志物

1.1 KL-6 KL-6为Ⅱ型肺泡上皮细胞表面抗原,是一种由MUC1基因编码、在Ⅱ型肺泡上皮细胞和气道上皮细胞外表面表达的糖蛋白,目前被认为是一种有应用前景的IPF诊断性生物标志物,其确切的功能尚不清楚。作为一种趋化因子,它能促进成纤维细胞在肺部的迁移、增殖和存活［7］。KL-6特异性相对较差,不同类型的间质性肺病患者的BALF中也可检测出。Zhu等［8］研究了73例不同类型的弥漫性间质性肺病患者,其中IPF患者34例,Ⅰ期结节病10例,超敏性肺炎15例,结缔组织疾病14例,并使用酶联免疫吸附试验检测这些患者的血清和BALF中的KL-6水平。结果显示,IPF 患者BALF 中KL-6水平为 (437±252)U/ml,高于实验所测的其他弥漫性间质性肺病患者,血清KL-6 水平与BALF 一致,联合检测可提高诊断准确性。

1.2 表面活性物质蛋白 (surfactant protein,SP) 肺表面活性物质主要由磷脂和SP 组成,SP 有SP-A、SP-B、SP-C和SP-D 4种,主要由Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌,其中SP-B、SP-C为小分子疏水性表面活性蛋白,主要参与肺泡表面张力的调节,SP-A、SP-D 为大分子疏水性表面活性蛋白,属于C型凝集素家族成员,主要参与肺宿主防御功能。Nishikiori等［9］的研究显示IPF 患者BALF 中SP-D 水平低于结节病患者,但血清SP-A 和SP-D 浓度高于结节病患者,SP-D 浓度的变化比SP-A 更为明显,因此IPF 的诊断可能需要多个标志物。

1.3 骨膜蛋白 骨膜蛋白是一种细胞外基质细胞蛋白,属于筋膜蛋白家族,可作为慢性过敏性疾病的介质,存在于纤维化病变区域,可于BALF 中测出,目前被认为是IPF的一种新型生物标志物［10-11］。Ohta等［12］比较了IPF 患者和其他高危疾病 (特应性皮炎、系统性硬皮病和哮喘)患者单体骨膜蛋白与总骨膜蛋白的比例,结果显示与KL-6和SP-D 相比,单体骨膜蛋白对IPF 的识别能力最强。传统的试剂盒可检测骨膜蛋白单体和寡聚体形式 (总骨膜蛋白),目前已开发了一种新的试剂盒,可用于单独检测特异性单体骨膜蛋白。在IPF的检测中,使用该试剂盒所测出的单体骨膜蛋白水平较总骨膜蛋白高。因此,骨膜蛋白可能成为诊断IPF的生物标志物。

1.4 骨桥蛋白 骨桥蛋白 (也称为分泌性磷蛋白1)是一种高度磷酸化的糖磷酸蛋白,具有酸性特征并富含天冬氨酸［13］,由肺泡上皮细胞产生,在IPF患者的BALF中也显著升高,作为一种细胞黏附和迁移分子,骨桥蛋白能显著增加成纤维细胞和上皮细胞的迁移和增殖,并与多种配体结合,参与许多病理生理反应。Gui等［5］的文章中提到骨桥蛋白可参与细胞的募集和黏附、免疫调节、细胞存活、骨重建和伤口修复。Pardo等［14］在实验中测定了18例IPF患者和10名健康对照者BALF中骨桥蛋白的含量,结果显示IPF患者BALF中的骨桥蛋白显著增加。但目前相关数据较少,骨桥蛋白在IPF发病机制中的具体作用以及它作为诊断标志物的敏感性和特异性尚不明确,对这一蛋白分子进行进一步的研究有较大的价值［15］。

1.5 S100蛋白 S100蛋白属于钙结合胞浆蛋白家族,通常以同二聚体或异二聚体形式存在。其成员在不同的组织或细胞类型中特异性表达,细胞内S100蛋白可参与细胞周期调控、增殖、分化、迁移、代谢、细胞动力学、信号转导和细胞死亡等过程。S100A4、S100A9 属于此类蛋白,S100A4通过激活成纤维细胞而促进肺纤维化,由于S100A4的细胞来源不同,其在肺纤维化发展中的确切作用目前仍不清楚,但有研究发现在BALF中,S100A4蛋白水平与患者IPF的发生密切相关［16］。Hara等［17］研究了28例IPF、15例特发性非特异性间质性肺炎、20例隐源性组织性肺炎、35例胶原血管疾病相关性间质性肺炎和23 名健康个体 (对照)的血清和BALF 中的S100A9 水平,研究结果表明与特发性非特异性间质性肺炎、隐源性组织性肺炎、胶原血管疾病相关性间质性肺炎和健康个体相比,IPF患者的BALF中的S100A9 水平显著升高,而血清差异不明显,且BALF中S100A9水平具有足够的特异性和敏感性,可以区分IPF和特发性非特异性间质性肺炎、胶原血管疾病相关性间质性肺炎。钙粒蛋白也属于S100蛋白质家族。Bargagli等［18］测定了16 例IPF 患 者、17 例结节病患者和7名健康者BALF 中钙粒蛋白B 的浓度,结果表明IPF组钙粒蛋白B浓度 ［(31.82±34.80)pg/g］明显高于结节病组 ［(7.05±12.79)pg/g］及对照组 ［(1.84±3.05)pg/g］,IPF 患 者BALF 中S100A4、钙 粒 蛋 白B(S100A9/MRP14)水平升高,可为IPF的诊断提供依据。

1.6 黏蛋白 黏蛋白是糖蛋白的一种,是由分泌细胞分泌的黏多糖组成,有形成凝胶的特殊能力,为凝胶状分泌物的关键组成部分。其中有2种大分子在气道和相关黏液中广泛表达,分别为MUC5AC 和MUC5B,MUC5AC 主要由近端气道产生,而MUC5B 主要表达于远端呼吸道［19］。在一项对IPF患者BALF的定量蛋白质组学的研究中发现,气道上皮细胞在中性粒细胞弹性蛋白酶和活化的嗜酸粒细胞的诱导下,MUC5B和MUC5AC这2种蛋白的表达量增加了20倍以上［20］,这些证据表明MUC5B和MUC5AC 在IPF的致病过程中发挥重要作用。目前没有相关数据表明MUC5B能否将IPF 与其他间质性肺病区分,但可能有助于IPF的早期诊断。

1.7 CCL 趋化因子是一种可诱导附近具有特定反应细胞定向趋化能力的细胞因子或信号蛋白,趋化性细胞因子根据其结构的不同,可分为CXC、CC、C和CX3C 4个亚族。其中,CCL18在人肺和血清中组成性表达,变态反应、纤维化和癌症等病变可使其水平进一步升高,提示CCL18可能参与稳态和炎症过程。在稳态条件下,CCL18对幼稚T细胞有一定的趋化活性,CCL18通过直接激活诱导免疫细胞的调节表型和功能,在肺纤维化过程中发挥重要作用［21］。现已有研究表明IPF 患者血清和BALF 中CCL18水平均高于特发性非特异性间质性肺炎、呼吸道毛细支气管炎间质性肺病/脱屑性间质性肺炎、隐源性组织性肺炎患者［22］。作为一种生物标志物,尽管CCL18 在肺间质纤维化中显示出一定的诊断价值,但目前尚未应用于临床诊断。

1.8 L1 细胞黏附分子 (L1-cell adhesion molecule,L1-CAM) L1-CAM 为一种细胞黏附分子,介导细胞与细胞外基质的相互接触,参与细胞的识别、活化及信号转导,sL1-CAM 为L1-CAM 的 可 溶 性 形 式。Zhang 等［23］研究了16 例IPF、12 例肺癌、12 例慢性咳嗽患者,测定BALF和血清中s L1-CAM 水平。结果显示:IPF、肺癌和慢性咳嗽患者BALF 中sL1-CAM 水平分别为 (10.87±0.88)、 (6.34±0.67)和 (5.43±0.65)μg/L。IPF 组BALF中s L1-CAM 浓度明显高于肺癌组和慢性咳嗽组,患者血清中s L1-CAM 浓度也明显升高,提示L1-CAM 可能参与IPF的发病机制,并有可能作为IPF的诊断性标志物。

1.9 基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase,MMP) MMP是由Ⅱ型肺泡上皮细胞产生的一种内肽酶,此类酶在正常组织中表达水平较低,IPF 患者肺组织中表达增强,BALF 中可检测到多种亚型明显升高。其中MMP-7能够降解细胞外基质的多种成分 (包括信号分子和受体),可将其定位为纤维化的关键因素［24］。部分亚型可在肺癌［25］等疾病中检测到,目前无证据表明MMP可区分IPF和其他间质性肺病。

1.10 其他 关于IPF的临床研究［26］发现,仍然有一部分指标在BALF 中呈现出较高水平,如CXCL7、CXCL16、CCL24、FAM3B、CRAC1、ICI、ALP 等。目前应用最广泛的生物标志物是KL-6、SP-A 和SP-D,这3种生物标志物目前在日本已广泛应用于临床［27］。MMP 也为近年来研究的热点,其在肺间质纤维化诊断方面的价值得到了大部分学者的认可,但BALF 中关于这些指标的研究仍较少,因此在诊断中仍存在一定的不确定性。

2 与疾病进展、预后相关的生物标志物

2.1 热休克蛋白 (heat shock protein,HSP)及其抗体

HSP是存在于内质网的一种分子伴侣,对内质网中前胶原蛋白的正确折叠起至关重要的作用［28］。HSP47属于Serpin蛋白家族,由Serpin H1基因编码［29］。研究表明IPF 患者HSP47表达增加,而且发现肺中HSP47 表达水平较高的IPF患者的预后较HSP47 表达水平较低的患者差［30］。Mills等［31］检测了107例IPF患者和66例其他间质性肺病患者血清和BALF中HSP72及其抗体水平,结果显示所有的样本均可检测到不同水平的HSP72,血清中抗Hsp72 IgG 和IgGAM 的浓度在IPF患者进展期与非进展期中差异无统计学意义,但BALF 中抗Hsp72抗体IgGAM 的浓度与IPF患者肺活量和DLCO 占预计值百分比呈正相关,高浓度的IgGAM 与患者生存率的提高相关。

2.2 MMP 在一项对肺间质纤维化模型小鼠的研究中发现,大多数MMP 有促进肺间质纤维化发展的作用,但MMP-13 和 MMP-19 具 有 抗 纤 维 化 作 用,MMP-1 和MMP-10有可能限制损伤后的纤维化作用［32］。在肺间质纤维化的过程中,MMP 的调节受到影响,从而积极促进疾病进展［33］。Mc Keown等［34］随访了20例IPF患者和8名健康者,发现早期死亡患者 MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9及蛋白通透性指数均高于对照组,肺功能迅速下降超过1年的患者MMP-8和MMP-9水平较高,而且BALF中MMP-7与DLCO 呈弱相关,MMP-3与FVC 呈弱相关,MMP-7水平升高与死亡率增加具有一定的相关性。

2.3 内皮抑素 内皮抑素是一种血管生成抑制剂,为胶原蛋白ⅩⅤⅢ的一个羧基末端蛋白水解酶片段,为内皮细胞基底膜降解的标志物［35-36］,还可减少博来霉素诱导的肺间质纤维化早期BALF 中浸润的炎性细胞数量［37］。Richter等［38］在对IPF患者BALF 中内皮抑素的含量的研究中发现,所有IPF患者和正常对照者的BALF中均可检测到内皮抑素,但IPF患者水平较正常者高,BALF 中内皮抑素与FVC和DLCO 呈负相关,表明内皮抑素水平与肺功能损害程度相关,并且这项研究使内皮抑素抑制剂成为治疗肺间质纤维化的一种可能手段。

2.4 CCL 一项对39例IPF患者的研究［39］中发现,19例(48%)在确诊为IPF后5年内死亡,存活患者的DLCO 显著高于非存活患者,研究人员使用夹心酶联免疫吸附试剂盒测定了这些患者BALF中CCL的水平,检测到CCL3水平在存活和非存活患者之间没有差异,7例患者BALF 中检出CCL17,其中6 例5 年内死亡。10 例BALF 中检出CCL22,仅1 例存活,结果表明了BALF 中CCL17 和CCL22水平升高可能预示IPF 患者预后不良。虽然以上指标缺乏诊断特异性,但它们可能为与纤维化相关的间质性肺病的可靠预后标志物。

2.5 钙粒蛋白B Bennett等［40］研究了30 例IPF 患者和30名健康人BALF中钙粒蛋白B和KL-6的浓度,结果显示IPF患者BALF 中钙粒蛋白B 和KL-6均显著高于健康对照者,IPF患者中表现为慢性呼吸衰竭 (n=15)的钙粒蛋白B和KL-6的浓度明显高于无呼吸衰竭的患者,2种生物标志物浓度较高 (＞75%)的患者病情较严重,且第1秒用力呼气容积占预计值百分比、FVC占预计值百分比、残气量占预计值百分比、肺总量占预计值百分比、DLCO占预计值百分比、6分钟步行距离和BALF 中性粒细胞百分比较低。BALF中的钙粒蛋白B和KL-6可作为IPF预后生物标志物,可区分严重和晚期患者,联合检测这2种生物标志物有可能为IPF严重程度分层。

2.6 KL-6 肺间质纤维化患者由于基底膜受损,肺泡中KL-6水平升高,进而转移至血液中使血液中KL-6水平升高。研究发现IPF 患者BALF 及血清中KL-6 水平升高明显,且与FVC和DLCO 呈负相关,提示BALF中KL-6水平在病情监测方面具有显著作用［41］。

在Murata等［42］的一份病例报告中提到,在IPF 急性加重期,活动性纤维化病灶中有明显的骨膜蛋白积聚,亚急性纤维化期骨膜蛋白积聚程度明显强于慢性纤维化期。也有相关文献指出端粒长度、MUC5B 基因多态性可预测肺间质纤维化进展及不良预后,但其在BALF中的作用目前尚不明确。

随着医疗手段的不断提高,目前关于肺间质纤维化的生物标志物越来越多,大多数实验只对一种或几种标志物进行研究,缺乏系统性、整体性的认识,检测一种指标的意义较小,联合检测多种指标可提高诊断的准确性,具有意义的相关生物标志物可纳入风险评分系统,以实现IPF患者的个体化治疗。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突