肖红梅

遵义医学院附属医院头颈肿瘤科(贵州遵义 563000)

头颈部肿瘤是最常见的一大类恶性肿瘤，主要包括颈部、口腔颌面部位以及耳鼻咽喉部位的肿瘤，虽然肿瘤种类繁多，但约90%患者肿瘤属于鳞状细胞癌[1-3]。由于头颈部肿瘤发病部位特殊，患者的生活品质受到巨大影响。在临床上，由于头颈部肿瘤发病特征不明显，因此患者确诊时往往处于晚期，而目前临床上头颈部肿瘤的诊断主要还是影像学的检测，诸如CT、MRI[4]，因而针对头颈部肿瘤标志物的探索，对于深入分析头颈部肿瘤的致病机制以及患者预后判断具有很大的应用价值。目前头颈部肿瘤标志物主要是一些鳞状细胞癌相关的分子，如硫酸软骨素多糖蛋白4(CSPG4)[5]、钙磷脂结合蛋白A2(Annexin A2)[6]等，但这些肿瘤标志物在敏感性或特异性方面表现较弱，因此开发新的针对头颈部肿瘤的特异性肿瘤标志物对于提高头颈部肿瘤的诊断具有重大意义。微纤丝关联蛋白2(MFAP2)是一种细胞外基质蛋白，与肌原纤维蛋白相互作用介导细胞内微纤丝的功能[7]。以往的研究发现MFAP2在肥胖、糖尿病和骨质疏松等疾病中发挥重要的功能[8-9]，然而关于MFAP2在头颈部肿瘤中的研究还很少，MFAP2表达与头颈部肿瘤临床病理特征的联系也未见相关的报道。本研究利用公共数据库分析MFAP2在头颈部肿瘤中的表达，特别是阐述其在早期头颈部肿瘤中的意义，并分析其表达与临床病理之间的联系，为头颈部肿瘤患者预后判断提供临床参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 76例头颈部肿瘤患者肿瘤组织及癌旁正常组织取材于遵义医学院附属医院，于2017年1月至2019年8月取材于肿瘤切除手术中。其中女37例、男39例，50岁以上患者51例，50岁以下患者25例，患者TNM分期按照AJCC头颈肿瘤第8版进行分类。

1.2 TCGA头颈部肿瘤样本资料 TCGA头颈部肿瘤数据库纳入本研究中，其中正常组织44例，肿瘤组织520例，其中肿瘤组织取自Ⅰ期肿瘤患者27例，Ⅱ期患者71例，Ⅲ期患者81例，Ⅳ期患者264例。根据肿瘤组织T分期来分类，T1期62例，T2期303例，T3期125例。根据患者是否存在淋巴结转移，N0为未发现淋巴结转移，病例数176例；N1定义为存在1～3个腋下淋巴结转移灶，病例数为67例，而N2定义为4～9个淋巴结转移灶，病例数为12例，N3定义为10个及以上淋巴结转移灶，有8例患者。根据是否存在人乳头瘤病毒(HPV)感染，520例头颈部肿瘤患者中有41例HPV阳性患者和80例HPV阴性患者，其余未纳入的患者具体特征未明确。

1.3 TCGA头颈部肿瘤数据库分析 运用UALCAN在线工具(http://ualcan.path.uab.edu/)处理TCGA头颈部肿瘤数据，选择TCGA分析模式，输入MFAP2基因名，选择TCGA数据集(head and neck squamous cell carcinoma)，然后选择Expression，即可展示出癌旁组织和癌组织中MFAP2相对表达量，然后根据不同病理特征进行分组分析MFAP2的相对表达水平。

1.4 实验材料 临床标本取材于遵义医学院附属医院外科切除手术中，立即置于超低温冰箱中保存，RNA提取试剂盒购于碧云天生物技术公司，逆转录试剂盒以及荧光定量PCR试剂盒购自全式金生物技术公司。用于荧光定量PCR的引物由上海生工有限公司合成，并HPLC验证。其余化学试剂均为分析纯，购于上海国药公司。

1.5 组织中RNA的提取 取10 mg左右的组织，加入1 mL 的RNA提取试剂，在组织匀浆机下充分匀浆组织，室温静置裂解15 min。加入500 μL的三氯甲烷，充分振荡，室温静置5 min后，在4℃下14 000g离心10 min，小心吸取上清液转移到新的离心管中，注意不要吸到白色中间层。加入500 μL异丙醇溶液沉淀RNA，白色沉淀即为总RNA，使用75%乙醇洗涤白色沉淀2次，风干后，加入DEPC预处理的去离子水，用于后续实验。

1.6 反转录和实时定量PCR 按照反转录试剂盒说明书配制反应体系，将RNA反转录成第一链cDNA，加入基因组DNA去除试剂，去除残余的基因组DNA，防止影响后续实验。实时定量PCR采用SYBR法，采用ROX进行荧光校正，分析方法采用2-ΔΔCT。MFAP2的上游引物序列为5′-CGCCGTGTGTACGTCATTAAC-3′, 下游引物序列为5′-CCATCACGCCACATTTGGA-3′，扩增产物大小112 bp。

2 结果

2.1 MFAP2在TCGA头颈部肿瘤数据库中表达 TCGA头颈部肿瘤数据库中44例癌旁正常组织和520例肿瘤组织纳入分析，见图1表1，MFAP2基因在头颈部肿瘤组织中的表达显著高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.001)。进一步在不同肿瘤分期患者中分析MFAP2表达的变化，发现27例Ⅰ期头颈部肿瘤患者肿瘤组织中MFAP2的表达较癌旁正常组织也显著增加，差异有统计学意义(P<0.001)。其余分期患者的MFAP2表达水平均显著高于正常组织，但不同分期患者肿瘤组织中MFAP2的表达无显著差异(P>0.05)，如图2-A，表2。而根据肿瘤组织分期来分析MFAP2的表达发现，在T1早期阶段，肿瘤组织中MFAP2的表达显著增加(P<0.001)，而且在更高阶段的T2和T3期肿瘤中MFAP2的表达进一步升高，见图2-B，表3，差异有统计学意义(P<0.001)。

表1 TCGA数据库中头颈部肿瘤组织和癌旁正常组织中MFAP2表达水平

2.2 TCGA头颈部肿瘤数据库中MFAP2表达与淋巴结转移和HPV感染的关系 176例无淋巴结转移的头颈部肿瘤患者肿瘤组织中MFAP2的表达也显著增加(P<0.001)，无淋巴结转移患者的肿瘤组织中MFAP2的表达与存在淋巴结转移患者的肿瘤组织的MFAP2表达无显著的差异(P>0.05)。无论是HOV阳性还是阴性患者，其肿瘤组织中MFAP2的表达都显著高于正常组织，而HPV阴性患者肿瘤组织中MFAP2的表达则显著高于HPV阳性患者，差异有统计学意义(P<0.001)。见图3。

注：*P<0.001

表2 不同进展阶段头颈部肿瘤组织中MFAP2表达水平

注：*与正常组织比较

2.3 分析76例头颈部肿瘤患者肿瘤组织与癌旁组织中MFAP2 mRNA表达 实时定量PCR的结果显示，76例正常组织的MFAP2 mRNA相对中位数表达水平为2.462(95%CI：2.228～3.039)，而肿瘤组织中MFAP2的相对中位数表达水平为5.366(95%CI：5.107～5.8)，76例肿瘤组织中MFAP2的表达显著高于癌旁的正常组织，差异有统计学意义(P<0.001)。见图4。

2.4 MFAP2表达与临床病理特征之间的相关性 根据中位数，将76例头颈部肿瘤患者分为低表达组28例和高表达组48例。分析MFAP2表达与患者性别、年龄、TNM分期、肿瘤大小以及是否存在淋巴结转移和远端肿瘤转移。如表1所述，肿瘤组织中MFAP2的表达与头颈部肿瘤患者性别和年龄均无显著的相关性(P>0.05)。而根据患者TNM分析将作者分为Ⅰ～Ⅱ和Ⅲ～Ⅳ期，根据肿瘤大小是否>3 cm，分析发现低表达MFAP2组有24例患者肿瘤大小<3 cm，有4例患者的肿瘤大小>3 cm。而MFAP2高表达组有21例患者肿瘤大小<3 cm，27例患者肿瘤大小>3 cm，MFAP2表达水平与肿瘤大小密切相关(P<0.001)。76例患者中有36例远端转移患者和40例无远端转移患者，其中36例远端转移患者中MFAP2高表达有28例(77.78%)，而MFAP2低表达有8例(22.22%)。76例患者中淋巴结转移的患者有33例，43例无淋巴结转移。33例存在淋巴结转移的患者MFAP2高表达组有26例(78.79%)，而43例无淋巴结转移的患者MFAP2高表达的有22例，MFAP2低表达的患者有21例。见表4。

注：A：根据患者分期分组，分析MFAP2在不同进展阶段的表达水平；B：分析MFAP2在不同肿瘤分期中的表达。*与正常组比较P<0.001

图2 MFAP2在不同分期头颈部肿瘤患者肿瘤组织中的表达

注：*与正常组织比较

注：A：根据患者有无淋巴结转移分组，分析MFAP2的表达，N0为未发现淋巴结转移， N1定义为存在1至3个腋下淋巴结转移灶，N2定义为4～9个淋巴结转移灶，N3定义为10个及以上淋巴结转移灶；B：按照患者有无HPV感染进行分组分析MFAP2的表达。*与正常组织比较P<0.001；△与HPV阳性肿瘤比较P<0.001

图3MFAP2表达与淋巴结转移和HPV感染的关系

注：*P<0.001

图476例头颈部肿瘤患者肿瘤组织与癌旁组织中MFAP2的mRNA表达

表4 MFAP2基因的表达与头颈癌患者临床病理特征的相关性 例

3 讨论

头颈部肿瘤由于病发部位特殊，患者的生活品质受到严重的影响，临床上头颈部肿瘤主要包括甲状腺癌、口腔癌、喉癌等[10]。临床上头颈部肿瘤的治疗主要是以外科手术为主的综合治疗，这是由于外科手术治疗在早期患者中疗效较好，但70%以上的患者确诊时已是中晚期，存在局部复发或远端转移的高风险，因此化疗和放射治疗等综合治疗方式在头颈部肿瘤的治疗得到认可[11-12]。临床研究中也发现头颈部肿瘤的预后与肿瘤大小、是否远端转移等因素存在密切联系[13-14]，另一点值得注意的是头颈部肿瘤不同发病部位，临床表现也比较复杂，而且头颈部肿瘤的早期表现易被忽视[15]。生物标志物的发现在恶性肿瘤的早期发现以及预后评价方面发挥着重要的作用，在头颈部肿瘤中，生物标志物的研究还不完善[16-17]。因此本研究从发现新颖的头颈部肿瘤生物标志物出发，分析其在肿瘤负荷以及治疗效果评估方面的价值。

本研究首先利用生物信息学的方法分析TCGA头颈部肿瘤数据库，由于样本量较大，更有利于寻找新颖的具有统计学意义的生物标志物，本研究发现MFAP2基因在520例头颈部肿瘤组织中较正常组织显著增加，说明MFAP2极有可能在头颈部肿瘤的发生过程中发挥重要的功能。进一步本研究分析了不同分期肿瘤患者组织中MFAP2的表达，发现即使是早期患者，其肿瘤组织中MFAP2的表达也大量增加(P<0.001)，而头颈部肿瘤的早期诊断是对于提高头颈部肿瘤患者预后至关重要。为了进一步验证MFAP2在头颈部肿瘤不同进展阶段的意义，我们进一步分析了MFAP2在不同肿瘤阶段的表达差异，发现在肿瘤T1期，MFAP2的表达大量升高，肿瘤T1的MFAP2表达水平与更高进展阶段的肿瘤T2、T3期无显著差异(P>0.05)，而在分析有淋巴结转移的头颈部肿瘤患者和无淋巴结转移患者肿瘤组织中MFAP2的表达，本研究也发现MFAP2表达水平即使在无淋巴结转移的头颈部肿瘤患者中也显著升高，这些证据都说明即使在早期阶段，MFAP2在头颈部肿瘤组织中仍然是一个显著表达升高的分子，其在头颈部肿瘤的早期诊断中，具有非常大的潜力。人乳头状病毒(HPV)感染是头颈部肿瘤的致病因素之一[18-19]，那么MFAP2在HPV介导的头颈部肿瘤过程中有无作用呢？我们分析了MFAP2在HPV阴性和HPV阳性的头颈部肿瘤组织中的表达差异，需注意的是MFAP2在HPV阴性头颈部肿瘤组织中的表达显著高于HPV阳性的肿瘤组织，这说明在头颈部肿瘤中MFAP2与HPV也存在某种紧密的联系，值得深入的研究探讨。本研究进一步采用临床收集的头颈部肿瘤标本，验证头颈部肿瘤数据库的分析结果。结果进一步证实MFAP2在头颈部肿瘤中高表达，并且我们也进一步分析了MFAP2的表达与头颈部肿瘤患者临床病理特征之间的联系，结果进一步表明MFAP2与肿瘤大小、患者分期、肿瘤分期、有无淋巴结转移和远处转移都存在密切联系，而与患者的性别和年龄无显著的关联。这些证据进一步证明MFAP2作为头颈部肿瘤患者预后的潜在价值，特别是对于早期患者来说，具有广阔的应用前景，同时MFAP2在患者预后生存期以及治疗反应中的价值也值得进一步深入的研究。