蒋菲娅 刘文 伍洋科 谷俊远

研究进展，以阐明mTOR信号通路在肺纤维化中的作用机制。

mTOR

mTOR即哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)，它是磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)下游的一种重要的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。mTOR由两种蛋白复合物组成，即对雷帕霉素敏感的mTORC1和不敏感的mTORC2。mTORC1由mTOR、mLST8、Raptor、DEPTOR和PRAS40组成，mTORC1的上游调节因子主要是胰岛素、生长因子、血清、磷脂酸、氨基酸及氧化应激等刺激因素，其主要促进能量代谢、蛋白质合成、脂肪生成、抑制溶酶体形成和自噬作用。mTORC1的下游主要是S6K1及4EBP1这两个效应器，两者在蛋白质合成过程中发挥重要作用。磷酸化核糖体蛋白S6激酶(P-S6K1)是mTORC1活化的标记，激活的mTORC1通过磷酸化下游的S6K1和4EBP1促进细胞生长关键蛋白的转录、翻译和自噬，影响了蛋白质的合成和细胞生长；mTORC2由mTOR、mSIN1、mLST8、DEPTOR、Protor、和Rictor组成，其活性受胰岛素/PI3K信号通路调控，AGC蛋白激酶家族(PKC、PKA与PKG)是mTORC2的主要下游信号，mTORC2在调节细胞存活和代谢以及肌动蛋白细胞骨架等方面起重要作用[4]。

mTOR是细胞生理病理进程中的关键调控因子，可受细胞内外营养物质、生长因子、能量转化、缺氧应激和激素水平等多种因素的影响，其介导的信号通路在生命过程中起着非常重要的作用。mTOR信号通路异常与临床上多种疾病有关，如肿瘤、增生性疾病、自闭症谱系障碍、2型糖尿病、神经退行性疾病以及免疫失调等。近年来，越来越多研究发现mTOR信号通路与肺纤维化的发生和病理进展密切相关，但其具体病理机制需要我们进一步去研究。

mTOR与肺纤维化的关系

一、mTOR与自噬

细胞自噬是指细胞通过溶酶体清除“废物”的自我消化过程，包括异常修饰的蛋白质或蛋白质聚集体以及受损的细胞器，细胞自噬以细胞质内自噬体的出现为标志。自噬主要分为三种类型，微自噬/小自噬、巨自噬/大自噬、和分子伴侣介导的自噬。微自噬是一种非选择性的溶酶体降解过程，溶酶体直接通过溶酶体膜的突起、隔膜和内陷，吞噬和降解细胞质中的底物。分子伴侣介导的自噬是溶酶体蛋白水解的主要途径之一，它具有高度的选择性，只能降解溶酶体中某些特定的可溶性蛋白质而不能降解细胞器。这些可降解蛋白质含有特定的氨基酸序列，可被热休克蛋白分子伴侣或其复合物识别和结合，然后直接运输到溶酶体进行降解。通常说的细胞自噬即巨自噬，在巨自噬过程中，由细胞膜、内质网或高尔基体衍生的双层膜结构，通过胞质物质和某些细胞器、蛋白质等包合，形成自噬体(autophagosome)，然后自噬体的外膜与溶酶体膜融合形成自噬溶酶体，并最终在一系列水解酶的作用下将其所包裹内容物降解[5]。自噬作为细胞的一种自我保护机制，广泛存在于真核细胞中，在调节细胞存活和死亡中起着至关重要的作用。在正常情况下，自噬可通过降解细胞内异常蛋白质、受损或多余的细胞器、细胞内的病毒和细菌，以维持细胞功能[6]。缺氧、营养不足、生长因子缺乏、微生物感染、内质网应激和氧化应激等因素都能诱发细胞自噬[7]。近年来，自噬作为除细胞凋亡以外的另一种重要的程序性死亡方式，已被证实参与了许多疾病的发生发展过程。自噬的发生存在多种信号通路，其中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信号通路在自噬过程中起着关键的调节作用[8]。PI3K/Akt/mTOR信号通路在调节细胞生长与存活、细胞增殖、细胞运动、以及蛋白质合成和转录等生理功能方面发挥着重要作用，是细胞内重要的信号通路之一[9]。在自噬启动阶段，mTOR扮演着关键调控因子的角色，对自噬的形成和成熟起着关键作用。mTOR的激活可以抑制自噬的发生，是自噬的负性调控分子。ULK与酵母Atg1作用相似，作用于mTOR复合物的下游。ULK与Atg13和支架蛋白FIP200形成一个大的复合物，是哺乳动物启动自噬的重要调节因子。当营养充足时，mTOR被激活，继而使Atg13高度磷酸化，降低其与ULK的结合能力，随之ULK的活性降低，从而抑制自噬的发生。在缺氧、营养匮乏的情况下，AMP/ATP比值升高并活化AMPK，被活化的AMPK直接作用于mTOR或通过TSC1/TSC2抑制Rheb活性间接作用于mTOR，并抑制其活性，引发ULK激酶活性升高和Atg13、ULK去磷酸化，导致ULK自磷酸化和Atg13、FIP200磷酸化，从而促进细胞自噬的发生[10]。

肺间质纤维化是许多肺部疾病中导致肺功能衰竭的常见病理过程，其具体发病机制迄今为止仍未得到明确的阐明。一般认为是多种因素综合作用的结果，涉及肺成纤维细胞活化成肌成纤维细胞，并在肺间质中聚集、致纤维化细胞因子表达上调、细胞外基质合成增多及降解减少、单核巨细胞等炎症细胞的浸润、氧自由基生成过多及清除减少等方面。细胞自噬作为哺乳动物细胞对抗外界压力或环境改变的自我调控方式，可以利用溶酶体降解细胞内受损的细胞器和入侵的微生物来维持细胞内稳态。有文献报道肺纤维化过程中自噬水平发生了改变，肺纤维化模型组与对照组相比，肺组织自噬水平显著降低，而提升肺组织的自噬水平明显减轻了肺纤维化的程度[11]。mTOR能够通过调控自噬参与IPF的调节。肺纤维化患者的肺成纤维细胞也观察到mTOR通路持续激活，且p62表达和自噬体数目增加，LC3B的表达减少[12]，证明肺泡上皮细胞mTOR通路的过度激活，伴随自噬能力降低并参与肺纤维化的发病机制。在Ⅰ型聚合胶原上培养IPF成纤维细胞，异常的PTEN/Akt轴激活mTOR，高表达的mTOR抑制自噬活性，且IPF成纤维细胞的死亡减少[13]。雷帕霉素是一种常用的的mTOR信号通路特异性抑制剂，可抑制mTOR通路下游关键分子S6K1和4EBP1，在肺纤维化治疗中起重要作用[14]。目前研究报道，在早期急性肺损伤方面，wang等[15]在脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤模型中发现mTOR信号通路被激活，而经雷帕霉素干预后支气管肺泡灌洗液中相关炎性因子的表达水平明显减少。以上研究表明，mTOR的过度激活及自噬能力的降低是包括肺泡上皮细胞和成纤维细胞等多细胞诱导的肺纤维化的原因之一。通过mTOR调节调控自噬能力可能是治疗肺纤维化的一种合理方法。

二、mTOR与肺成纤维细胞表型转化

肺纤维化的病理表现为肺间质内大量基质蛋白积聚和肌成纤维细胞聚集与活化，α平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)是肌成纤维细胞的标志蛋白。细胞外基质(ECM)蛋白的过度沉积也是肺纤维化的特征之一，在肺纤维化过程中，细胞外基质的生物力学特性发生改变并通过影响转化生长因子-β1( transforming growth factor β1，TGF-β1)的活化促进肺纤维化的发展。肌成纤维细胞是一类活化形式的成纤维样细胞，其增殖活跃能够分泌ECM蛋白，是ECM 的主要来源。肌成纤维细胞分泌ECM在肺损伤修复过程中是必不可少的，正常情况下损伤修复活跃期结束时，肌成纤维细胞会通过细胞凋亡逐渐降解。但肺处于长期慢性损伤或IPF等病理情况下，肌成纤维细胞持续存在并引起ECM 过度沉积，ECM发生病理性改变最终发展为肺纤维化。随着研究的深入，发现mTOR可能参与了成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化的调控。在IPF患者中，肺内肌成纤维细胞存在过度增生和持续凋亡并存。有研究者观察到，在IPF患者肺分离的成纤维细胞中，LC3B水平降低，磷酸化Akt和磷酸化mTOR增加[12]。Tulek等[16]在雷帕霉素抗博来霉素诱导的大鼠肺纤维化研究中也发现，在肺纤维化早期阶段使用mTOR信号通路抑制剂，能减少成纤维细胞增殖，对肺纤维化的发生有一定的抑制作用。PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)是mTOR信号通路上游的调节蛋白，有研究表明，肺纤维化患者成纤维细胞PTEN表达降低，PTEN过度表达时，成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞的过程受到明显抑制，而PTEN缺失的成纤维细胞更容易向肌成纤维细胞转分化，暗示着PTEN下游的mTOR信号通路也可能参与了肌成纤维细胞的转分化[17]。为进一步探讨了mTOR信号通路在肺纤维化发病中的作用机制，研究发现肺组织中mTOR的活化伴胶原蛋白mRNA表达增多并与肺纤维化形成有关，提示两者具有相关性。研究表明异常激活的mTOR通路参与了肺纤维化的发病进程，其机制可能与肺组织内肌成纤维细胞增生、纤维化细胞因子表达增加，从而促进了胶原蛋白的合成有关。也有数据显示，在体外培养的IPF患者肺纤维母细胞中使用mTORC1/2抑制剂P529，有效抑制了TGF-β诱导的肌成纤维细胞的分化和基质金属蛋白酶的沉积[18]。证明抑制mTOR通路的异常活化可减少细胞外基质沉积，缓解肺纤维化胶原蛋白形成，进而达到抑制或减轻肺纤维化发生与发展的目的。

三、mTOR与EMT

上皮间质转分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)即上皮细胞受到持续性损伤转变成间充质细胞，细胞功能发生改变，同时上皮细胞标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达减少，间质标志物ɑ-平滑肌动蛋白(α-SMA)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达增加。现普遍认为，持续的肺泡上皮损伤导致的上皮间质转分化与特发性肺纤维化关系密切，TGF-β1过表达是导致EMT重要的分子机制。Molina等[19]用TGF-β1诱导人肺泡上皮细胞，发现肺泡上皮细胞中α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白、波形蛋白等表达增加且细胞形态转变为成纤维细胞，证实TGF-β1可诱导EMT发生。经过深入研究发现，TGF-β1主要是通过Smad依赖途径和非Smad依赖途径诱导EMT的发生[13]。TGF-β1/Smads诱导下游的转录因子Snail导致α-SMA表达增加，促进EMT；mTOR信号通路异常也参与EMT过程。有研究表明TGF-β1激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，可促进细胞内Snail1、 Snail2、Twist 、和E盒结合锌指蛋白(ZEB1、 ZEB2)等核转录因子表达，直接抑制E-cadherin表达，从而促进EMT发生。此外，TGF-β1激活PI3K/AKT/mTOR信号通路可使基质金属蛋白酶水平上升，促进 E-cadherin 的降解，间接促进EMT发生[20]。也有研究发现，激活mTOR信号通路抑制自噬活化能有效诱导上皮细胞分化，加速上皮间质转化过程，进而促进肺纤维化的发生与发展。瘦素可经过PI3K /Akt /mTOR途径抑制A549细胞的自噬，从而加速其EMT进程[21]。在小鼠肺纤维化的模型中，使用雷帕霉素阻断mTOR通路可抑制上皮细胞ɑ-SMA上调和E-cadherin下调，有效抑制了博来霉素诱导的肺纤维化并减弱体内的上皮间质转化[22]。因此，阻断mTOR可通过调节上皮间质转化抑制肺纤维化的发展。

总 结

肺纤维化的发病率和死亡率不断上升，严重威胁着人类的生命健康，目前缺乏较佳的治疗方案，其常规应用的药物，如N-乙酰半胱氨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂、抗氧化剂、细胞毒药物等，均无明显疗效，且副作用较大，不能从根本上解决问题。随着研究的不断深入，发现mTOR通路过活化和表达水平增加参与肺纤维化的发生发展，mTOR可能是通过调控细胞自噬、成纤维细胞表型转化和上皮间质转化等过程参与肺纤维化的调节。抑制mTOR信号通路也在实验动物中取得了较满意的结果，因此靶向调控mTOR信号通路有望为肺纤维化的诊疗提供新的靶点。