吴桂清 王亚红 刘刚

特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种病因不明的、严重的进行性间质性肺疾病(Interstitial lung disease, ILD)，是特发性间质性肺炎中最常见、最致命的一种[1]。目前其发病率和死亡率居高不下，仍难以治疗，除肺移植外，目前IPF的治疗效果欠佳，大多数患者肺功能和生活质量逐渐下降，IPF的中位生存期为3～5年[1-2]。IPF的特点是肺泡上皮细胞和成纤维细胞异常活化、分泌过多的细胞外基质(包括基质金属蛋白酶)，成纤维细胞增殖、向肌成纤维细胞分化，以及肺泡结构的丧失[3-4]。在肺纤维化发病进程中，多种基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)调控失常，有证据表明它们不仅在组织的异常重塑中起着核心作用，还可能促进纤维细胞的跨内皮和组织迁移，并参与细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的重构[2]。虽然MMPs在IPF发病过程中所起的重要作用已被广泛研究，但目前IPF的具体发病机制仍未清楚。

MMPs是一种能降解细胞外基质和大量非基质蛋白的蛋白酶，是锌离子依赖的内肽酶，于1961年首次在非洲爪蟾的变态尾皮中被发现，其最后一个成员(MMP-28)于40年后被发现,目前老鼠体内发现有23种，人类有24种。MMPs根据底物的特异性可分为以下七种：(1)间质胶原酶(MMP-1、-8、-13和-18)；(2)明胶酶(MMP-2和-9)；(3) 间质溶解素 (MMP-3、-10和-11)；(4)膜型MMPs (MMP-14、-15、-16、-17、-24、-25)与质膜相连；(5) 基质溶解素(MMP-7和-26)；(6)金属弹性蛋白酶(MMP-12)；(7) 其他基质金属蛋白酶(MMP-19、-20、-23和-28)[5]。MMPs是一组降解ECM的主要酶[6]，在正常条件下活性很低，主要负责ECM的降解，还能脱落细胞膜蛋白，并加工和切割多种生物活性介质，如生长因子、细胞因子和趋化因子，调节细胞增殖、粘附、融合、分化和凋亡等多种功能，但是在肺纤维化发病和炎症组织的修复或重塑过程中它们的活性增加[2]。以下将对目前已发现的部分种类MMPs在IPF发病中的机制进行探讨。

通过在小鼠模型的研究揭示MMPs参与肺纤维化发病的可能机制

一、MMP-3

MMP-3 (间质溶解素-1)在体外主要由上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肺泡巨噬细胞、单核细胞表达，可降解Ⅳ型胶原。与对照组相比，MMP-3在IPF患者的肺组织中主要在支气管和肺泡上皮细胞、间质成纤维细胞、肺泡巨噬细胞和其他白细胞中表达更多,在IPF诊断后3年内死亡的患者中肺泡灌洗液中MMP-3 的表达会明显升高[5]。

有研究发现MMP-3在IPF患者的肺组织和博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化中均有上调作用，而MMP-3基因敲除的小鼠对博莱霉素所致的肺纤维化起保护作用[2]。YAMASHITA CM等的研究发现MMP-3可通过激活Ⅱ型肺泡上皮细胞中的Wnt-β-catenin信号通路，增加肺上皮细胞中的E-钙粘蛋白(E-cadherin)的裂解，并诱导肺上皮细胞发生上皮间质转化(Epithelial to Mesenchymal Transition，EMT)，促进肺纤维化的进展[7]。

二、MMP-7

MMP-7(基质溶解素)由肺上皮细胞、单核吞噬细胞和纤维细胞表达[8]。MMP-7是IPF患者中表达最高的基因之一，血浆MMP-7水平被证实为诊断IPF的生物标志物[9]，随时间的变化仍升高，可预测高危患者[10]。

MMP-7敲除小鼠对博莱霉素所致肺纤维化起的保护作用，推测MMP-7有促肺纤维化作用[5]。其机制是可能通过切割E-cadherin激活上皮细胞[5]。另外，MMP-7可切割和激活骨桥蛋白，也可被骨桥蛋白诱导和激活，而骨桥蛋白可增加肺间质成纤维细胞中I型胶原和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1的表达，降低MMP-1的表达，表明MMP-7和骨桥蛋白之间的双向调节在IPF的促纤维化中起重要的作用[2]。

三、MMP-8

MMP-8(中性粒细胞胶原酶)来源于多形核白细胞(Polymorphonuclear leukocyte, PMN)、淋巴细胞、肺上皮细胞、成纤维细胞、纤维细胞、活化的巨噬细胞等[5]。在IPF患者的血和肺组织匀浆、肺泡灌洗液MMP-8水平均升高[2]。CRAIG VJ等研究发现IPF肺中表达MMP-8的主要细胞是巨噬细胞和气道上皮细胞，中性粒细胞中MMP-8水平没有改变，但发现报道血浆和肺泡灌洗液 MMP-8水平与IPF患者的肺功能下降和/或死亡率不相关[11]。

MMP-8基因敲除小鼠对博莱霉素致肺纤维化起保护作用，与巨噬细胞炎症蛋白-1a和抗纤维化因子γ干扰素诱导蛋白-10(IFN-γ-inducible protein-10，IP-10)水平有关[5]。而在纤维细胞表达MMP-8的研究中，用MMP-8抑制剂可减少纤维细胞在体外迁移，提示MMP-8促进纤维细胞迁移[8]。

四、MMP-9

MMP-9(明胶酶B)由中性粒细胞、上皮细胞和内皮细胞表达[2]。MMP-9在IPF患者的肺组织和肺泡灌洗液中表达增加，免疫组化显示其主要分布在IPF肺的化生气道上皮细胞、肺泡及间质巨噬细胞中[5]。

博莱霉素处理的转基因小鼠在巨噬细胞中表达人MMP-9明显增多，而胰岛素样生长因子结合蛋白-3(Insulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP 3)明显低于野生型小鼠，提示巨噬细胞分泌的MMP-9可通过减少巨噬细胞分泌的IGFBP-3 发挥抗纤维化作用[5]。有研究发现TGF-β1可通过激活ERK 1/2信号通路诱导Thy-1阴性的肺成纤维细胞表达MMP-9，Thy-1阴性肺成纤维细胞系表现出较强的迁移能力和胶原基质收缩能力，这些结果均提示MMP-9的表达与肺成纤维细胞中Thy-1受体阴性相关[2]。最近在大鼠肺纤维化的实验模型中发现在肺纤维化早期由巨噬细胞释放的MMP-9增加，它可以增强成纤维细胞的迁移能力，当恢复过度时，成纤维细胞向损伤区域募集更多的成纤维细胞并分泌胶原，从而导致肺纤维化发生[12]。

五、MMP-12

MMP-12(巨噬细胞金属弹性蛋白酶)主要由巨噬细胞表达，也可由肺基质细胞表达[5]。在经典的细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导巨噬细胞活化过程中MMP-12的表达增加[5]。

MMP-12在博莱霉素诱导小鼠肺纤维化肺组织中上调[2]。然而，对炎症反应和纤维反应的推测作用却给出了相互矛盾的结果。一些研究表明MMP-12基因敲除对博莱霉素引起的炎症或纤维化没有明显影响[13-14]，但在抗Fas抗体诱导的肺纤维化模型中发现 MMP-12通过上调egfr1(主要通过TGF-β1参与肺纤维化)和cyr61(参与成纤维细胞对ECM的粘附)促纤维化基因的活性来促进纤维化[2]，提示MMP-12在TGF-β1信号通路的激活中起着重要的作用。在IPF患者肺泡灌洗液中由MMP-12切割的Ⅳ型胶原片段水平增加，提示MMP-12还可能通过切割ECM蛋白来参与IPF的发病[5]。

六、MMP-13

MMP-13 (胶原酶3)主要由成纤维细胞表达[5]。MMP-13是一种能切割纤维蛋白原的酶，在IPF患者的血浆中无增加，但在全肺及肺泡灌洗液中有增加[5]，主要分布在肺泡和细支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞中[15]。

MMP-13在肺纤维化实验模型中的作用取得的结果相互矛盾。MMP-13基因敲除小鼠对博莱霉素诱导的肺纤维化更明显，而对辐射性肺纤维化有保护作用[2]。此外，高氧致肺损伤后纤维反应无明显差异，但MMP-13基因敲除小鼠的炎症反应增加[2]。最近研究表明MMP-13基因敲除小鼠可导致博莱霉素致肺纤维化的延迟，提示MMP-13具有抗纤维化作用，其活性在纤维化过程中对肺修复和组织完整性恢复中起着至关重要的作用[15]。

七、MMP-19

MMP-19由单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞表达，在成纤维细胞中的表达依赖于ERK 1/2和p38信号通路[5]。

MMP-19在IPF患者肺组织纤维化区附近的增生性上皮细胞中高表达[2]。有研究表明，在体内和体外的上皮细胞MMP-19的水平与前列腺素内过氧化物合成酶2(Prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)的变化呈正相关，而PTGS2是一种抗纤维介质，这表明MMP-19可部分通过在肺泡上皮细胞中诱导该酶在纤维化发展中起保护作用[2]。与野生型小鼠相比，MMP-19基因敲除小鼠对博来霉素的肺纤维化反应更剧烈，可观察到大量的成纤维细胞及肌纤维纤维细胞灶，而成纤维细胞可合成更多的细胞外基质及具有明显的增殖和迁移活性,这表明MMP-19起到抗纤维化作用[16]。

八、MMP-28

MMP-28在肺中由上皮细胞和巨噬细胞表达[17]，目前有关MMP-28的研究较少。MMP-28主要在IPF患者的肺中检测到并定位于上皮细胞，其与异常伤口愈合有关，IPF比非IPF患者血清中MMP-28的浓度显著升高，尽管IPF和非IPF有相似的影像学形态，但不同的致病机制导致不同分子的表达，提示MMP-28可区分IPF与纤维化非IPF患者，MMP-28可能为提高IPF诊断确定性的提供一个有效的生物标志物[18]。

MMP-28是巨噬细胞极化的重要调控因子。研究表明MMP-28基因敲除小鼠M2表型极化减少，对博莱霉素所致纤维化的起保护作用[5]。MMP-28可促进巨噬细胞向M2表型细胞极化, 提供大量的纤维化因子促进成纤维细胞增殖和胶原合成[5]。MMP-28在肺腺癌细胞A549能通过激活TGF-β，诱导上皮间质转化(Epithelial to Mesenchymal Transition，EMT)，获得Ⅰ型胶原侵袭表型[5]。最近研究发现IPF患者的肺上皮细胞MMP-28表达上调，MMP-28以催化依赖性的方式促进上皮细胞的存活、增殖、迁移和EMT[19]。

MMPs对肺纤维化有潜在的贡献，但尚未在肺纤维化的动物模型中进行研究

体外研究表明，其它基质金属蛋白酶(即MMP-1、-2、-10、-11、膜型MMPs)也有可能促进纤维化的发生，但还没有在肺纤维化模型中使用基因靶向小鼠进行评估，我们根据已知MMPs在其他疾病或体外系统中的活性来推测它们的潜在活性[5]。

一、MMP-1

MMP-1 (胶原酶-1)MMP-1由成纤维细胞、巨噬细胞、支气管上皮细胞和内皮细胞表达，体外可降解Ⅰ-Ⅲ型胶原[5]。MMP-1在IPF患者的肺组织中表达增加，MMP-1主要分布于纤维间质上的增生异常上皮细胞[5]。

MMP-1基因敲除的小鼠已经产生，但尚未在肺纤维化模型中进行研究[5]。体外研究表明，MMP-1在IPF患者中起保护作用[5]。在肺泡上皮细胞中过表达人MMP-1增加了低氧诱导因子1a(Hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α)的表达，减少活性氧的产生,并促进肺泡上皮细胞增殖，迁移和抑制凋亡[20]。在IPF肺中明显上调的骨桥蛋白可减少肺成纤维细胞MMP-1的表达，并促进成纤维细胞和上皮细胞的增殖和迁移[2]。

二、MMP-2

MMP-2(明胶酶A)由气道上皮细胞、巨噬细胞、内皮细胞、肺成纤维细胞和纤维母细胞表达，体外可切割变性胶原和基底膜[8]。MMP-2在IPF肺组织中表达增加，主要分布在反应性气道上皮细胞和纤维母细胞[5]。

MMP-2基因敲除小鼠在未受攻击状态下是异常的，从出生后第3天到成年，生长速度减慢了15%，迄今为止，MMP-2基因敲除小鼠还没有在肺纤维化模型中进行研究[5]。MMP-2定位于IPF肺上皮基底膜的破裂附近，与基底膜的降解有关[5]。最近有研究报道MMP-2和MMP-9可通过EGFR/AKT/GSK 3β/β-catenin途径介导香烟烟雾提取物诱导EMT[21]。

三、MMP-10

MMP-10(间质溶解素2)由内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞表达[5]。MMP-10在IPF肺中表达增加，主要由肺泡巨噬细胞和上皮细胞表达[22]。

有报道MMP-10基因敲除小鼠感染铜绿假单胞菌的模型，还没有在肺纤维化模型中进行研究[5]。用氧化铈(柴油尾气组分)颗粒处理的大鼠肺纤维化区MMP-10的表达增加[5]。MMP-10在体外促进巨噬细胞迁移[5]。皮肤创伤愈合模型中MMP-10诱导巨噬细胞向M2表型极化与胶原酶活性增加有关[5]，提示MMP-10可能通过巨噬细胞介导的胶原酶降解表现出抗纤维化作用。虽然机制还未明确，免疫染色显示IPF肺组织中MMP-10的大量表达及血清MMP-10与疾病严重程度和预后有显著的相关性，提示MMP-10在IPF的发病机制中起重要作用[22]。

四、MMP-11

MMP-11(间质溶解素3)由成纤维细胞表达，在IPF中MMP-11的表达尚未被评估[5]。MMP-11基因敲除小鼠已建立，但尚未在肺纤维化模型中进行评估[5]。MMP-11激活了Notch信号，Notch通过TGF-β/Smad 3途径诱导成纤维细胞分化[23]，由此推测 MMP-11有可能参与IPF的发病。

五、MMP-14

MMP-14主要参与人和小鼠肺成纤维细胞相关的Ⅰ型胶原的切割，这是否是肺成纤维细胞在IPF患者中产生的最重要的Ⅰ型胶原酶尚不清楚[5]。MMP-14是IPF肺组织中表达最多的膜型MMPs (Membrane-type matrix metalloproteinases，MT-MMP)，由肺泡上皮细胞中表达[24]。

MMP-14(MT1-MMP)基因敲除小鼠出现严重的骨骼异常并在1个月大的时候损害了肺泡发育，肺泡表面积减少了约40%，死亡率增加，这排除了他们在肺纤维化模型中的分析[5],而其他类型MT-MMP基因敲除小鼠未见报道。MT1-MMP可通过增加间充质干细胞在小鼠肺中的募集减轻博莱霉素所致的肺纤维化，促进肺修复[5]。MMP-14能增强细胞的上皮间质转化活性,MMP-14作为内质网蛋白Nogo-b的下游新靶点，促进Ⅱ型气道上皮细胞A549中游离TGF-β1的释放，从而诱导细胞发生EMT，进而促进肺纤维化[25]。

基质金属蛋白酶抑制剂

MMPs的主要功能为降解ECM[26]，MMPs的活性受基质金属蛋白酶抑制剂(Tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMPs)的转录、前肽激活和抑制水平的严格控制，TIMP家族的四个成员(TIMP1-4)是MMPs最重要的内源性抑制剂，MMPs/TIMPs比例失衡在肺纤维化的发病过程中起重要作用[24]。

TIMP-1基因敲除的小鼠不影响博莱霉素引起的肺纤维化的发展程度；TIMP-2基因敲除的小鼠对博莱霉素的肺纤维化反应与野生型小鼠相似；TIMP-3基因敲除的小鼠对博莱霉素的肺纤维化反应比野生型小鼠更明显[24]。TGF-β1转基因小鼠肺组织中TIMP-1/-2/-3表达上调，MMP-9活性降低，MMPs与TIMPs失衡导致肺纤维化[27]。TIMP-4基因敲除小鼠的心功能受损，目前还没有关于其在肺纤维化模型中的相关数据[24]。总的来说，这些数据表明TIMP-3对肺纤维化的发生有明显的抗纤维化作用。

靶点治疗

目前临床实践指南推荐用于治疗IPF的药物是FDA批准的吡啡尼同和尼达尼布[1]，虽然这两种药物能减缓IPF患者肺功能的下降的状况，但这两种药物成本高，患者每年的费用达到9400万美元到9600万美元之间。除了接受肺移植手术，任何其他治疗都不能治愈IPF ，并且在患者选择长期药物治疗的安全性和有效性仍存在争议[28]。在肺纤维化发病机制中一些MMPs (如MMP-7等)促进纤维化，而另一些MMPs(如MMP-19等)对纤维化起保护作用[2]。大多数促纤维化MMPs的关键激活因子尚不清楚，这些激活剂也可能被证明是重要的治疗靶点[5]。目前使用广谱的小分子MMP抑制剂的Ⅲ期临床试验均以失败告终，其原因可能是MMPs在催化结构上有相似之处，抑制剂很可能抑制了大多数MMPs的活性，另外，由于MMPs的部分功能还涉及非催化结构域，甚至其在细胞内定位也会动态变化，因此开发MMPs相关的新蛋白质结合药物的需求迫在眉睫[2]。目前我们对MMPs在肺纤维化发病中的认识仍然有限，需要进一步研究以开发更有选择性的MMPs抑制剂或其他降低MMPs水平的药物。