毛旖川，周强，朱默，汪灵杰，郭凌川，李勇刚

醒后卒中是急性脑卒中的一种特殊类型，是指患者在睡眠中发生的卒中。由于患者发病时间不明确，常被排除在溶栓治疗之外。目前，临床上常采用DWI与T2-FLAIR的不匹配来观察缺血半暗带的存在与否及范围，并推测大致发病时间，但其准确性尚有待提高。临床上迫切需要寻找新的能准确预测醒后卒中患者动脉栓子形成时间、栓子成分及可溶性的定量影像学分析方法。MRI T1-mapping及T2-mapping技术能够定量评估病变组织的不同成分及水含量的差异，有望区分不同性质与成分的动脉栓子。本研究初步探讨MRI T1-mapping及T2-mapping技术用于兔颈总动脉血栓定量测量的可行性，为进一步开展脑卒中患者动脉栓子成分及形成时间MRI评估的临床研究奠定技术基础。

材料与方法

1．实验动物及模型制作

选用健康雄性新西兰大白兔20只，清洁级，2～3月龄，体重1.5～2.0 kg，随机分为4组，分别为4.5 h组、6.0 h组、8.0 h组及12.0 h组，每组5只。实验用兔均由苏州大学医学院实验动物中心提供。实验动物使用经苏州大学附属第一医院伦理委员会批准。

颈总动脉血栓模型采用颈总动脉内注射凝血酶的方法建立。具体方法如下：新西兰大白兔肌肉注射速眠新(0.2 mL/kg)及耳缘静脉注射1%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉后，取颈部正中切口，沿右侧胸锁乳突肌外侧缘分离出右侧颈总动脉(图1)，颈总动脉中段两端放置血管夹，中间长度约15 mm，微量注射器穿刺针抽取凝血酶10U及兔夹闭颈总动脉段内自体血，混合30～60 s，随后注射至夹闭的颈总动脉管腔内，5分钟后先松开近端血管夹，再过5 min后松开远端血管夹。止血后逐层缝合肌肉与皮肤，术后肌肉注射青霉素40万单位。MRI及手术病理发现局部颈总动脉血栓形成为建模成功。

2．磁共振检查

动物麻醉:各组兔颈总动脉血栓模型建立后根据相应的时间点进行MRI扫描，扫描前先经耳缘静脉注射地西泮(安定)1 mL，然后肌肉注射速眠新0.2 mL/kg。

MRI扫描序列及参数：MRI检查采用Siemens Skyra 3.0T磁共振成像系统，16通道膝关节线圈，兔子取俯卧位，头先进。扫描序列包括3D-TOF、T1WI、T2WI黑血、T1-mapping及T2-mapping序列。主要扫描参数：①3D-TOF序列，TR 20 ms，TE 3.11 ms，视野150 mm×150 mm，层厚1 mm，层数96层，层间距0 mm，扫描时间2 min 33 s；②冠状面T1WI黑血序列，TR 650 ms，TE 23 ms，视野150 mm×150 mm，层厚0.8 mm，层数10层，层间距0 mm，扫描时间53 s；③横轴面T1WI黑血序列，TR 731 ms，TE 10 ms，视野150 mm×150 mm，层厚2 mm，层数8层，层间距0 mm，扫描时间5 min 51 s；④横轴面T2WI黑血序列，TR 678 ms，TE 61 ms，视野150 mm×150 mm，层厚2 mm，层数8层，层间距0 mm，扫描时间2 min 32 s；⑤T1-mapping序列，翻转角分别为5°和26°，TR 15 ms，TE 2.49 ms，视野160 mm×160 mm，层厚2 mm，层数8层，层间距0 mm,扫描时间2 min 34 s；⑥T2-mapping序列，TE分别为11.2、22.4、33.6、44.8、56 ms，TR 1950 ms，视野160 mm×160 mm，层厚2 mm，层数8层，层间距0 mm，扫描时间5 min 37 s。

图像分析:所有图像均上传至PACS工作站，由2位有经验的影像诊断医师分别对MRI图像进行质量评价。根据图像有无伪影及变形、是否能分辨血栓等对图像质量进行评分：1分，图像伪影较多，变形严重，不能显示血栓，不能用于诊断；2分，图像有少许伪影，可分辨血栓，不影响诊断；3分，图像质量非常好，无伪影，血栓显示清晰。

T1值及T2值的测量：在Siemens Skyra 3.0T的工作站上直接打开T1-mapping的原始图像及伪彩图，首先预览T1-mapping的原始图像，观察血栓的走行及大小，然后将原始图像与伪彩图对应，在原始图像选择血栓中心位置及合适的大小勾画ROI，在伪彩图相应位置测量T1值。以同样的方法测量T2值。

3.病理学检查

MRI检查结束后，经兔耳缘静脉注射肝素(200 U/kg)抗凝，以空气栓塞法处死实验兔。解剖并游离右侧颈总动脉血栓，以4%的多聚甲醛液固定，石蜡包埋，行常规HE染色，镜下观察。

4.统计学分析

结 果

1.兔颈总动脉血栓模型成功率及病理检查结果

经病理证实，20只兔子均建模成功。兔颈总动脉血栓肉眼观察均呈红色血凝块，大小0.5～1.0 cm，边缘略不规则。各组血栓切片HE染色镜下显示淡粉色的纤维蛋白网罗大量红细胞，混杂有核细胞成分(图2)。

2.MRI图像质量评价及定量MRI测量

两位医师对20只颈总动脉血栓模型兔的MRI各序列图像质量评分均在2分以上，各序列图像质量主观评分结果的一致性较好(表1)。

兔颈总动脉血栓在3D-TOF图像上均表现为管腔内低信号的充盈缺损(图3)；T1WI、T2WI黑血序列图像上血栓均表现为高信号(图4～5)；T1-mapping原

表1 不同MRI序列图像质量评分结果

始图像上血栓表现为相对低信号，T1-mapping伪彩图可清楚显示血栓(图6)；T2-mapping原始图像上血栓表现为高信号，T2-mapping伪彩图可显示血栓(图7)。

建模后4.5 h、6.0 h、8.0 h及12.0 h组血栓T1值及T2值的平均值见表2。T1值各时间点组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。4.5 h组与6.0 h组的T2值差异无统计学意义(P>0.05)，余各时间点组之间的差异均有统计学意义(P值均<0.05，表3)。

表2 不同时间点血栓T1值及T2值

表3 各组间血栓T1值与T2值多重比较的P值

讨 论

醒后卒中血管内栓子的来源主要是心源性栓子和动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)斑块破裂后局部血栓形成或脱落的斑块，大脑中动脉是血管栓塞最常见的部位。人大脑中动脉的管径与家兔的颈总动脉管径相近，本实验构建新西兰大白兔颈总动脉血栓模型并进行MR成像研究，初步评估MRI T1-mapping及T2-mapping技术用于颅颈动脉血栓评价的图像质量及判断血栓形成时间的可行性，为进一步开展醒后卒中的临床MRI定量研究奠定基础。

目前，常用的动脉血栓动物模型建立的方法包括自体血栓栓塞法、光化学法及球囊损伤结合高脂饮食饲养法。本研究采用了操作简便、建模时间短的自体血栓栓塞法。自体血栓栓塞法通常为在目标血管内注射凝血酶或通过介入的方法在特定血管放置自体血栓。笔者对凝血酶注射法进行改良，抽取颈总动脉内的自体血与凝血酶混合后注射到两端夹闭的颈总动脉内。改进的凝血酶法在注射器中将自体血与凝血酶混合，形成一种高凝状态，一方面减少了穿刺时动脉血外溢，另一方面凝血酶能使形成的血栓块更好地固缩，以防自溶[1]。改良的凝血酶法一方面保证了血栓形成的成功率，另一方面克服了血管介入操作的技术难题，为血栓定量MRI测量研究提供了简单易行的动物模型建模方法。

本研究中，MRI T1-mapping及T2-mapping成像在保证图像信噪比的前提下，采用大矩阵、小视野进行扫描，提高了图像的空间分辨率并降低了测量误差。结果表明T1-mapping及T2-mapping的图像质量较高，扫描时间短，能够满足临床诊断要求。

T1-mapping及T2-mapping是MRI定量测量最新发展起来的技术，相关研究表明T1-mapping及T2-mapping技术能较敏感地反映组织成分及含水量的细微变化[2,3]。Caspar等[4]采用T1-mapping和T2-mapping技术研究心内血栓的T1值和T2值的变化，发现形成时间小于一周的新鲜心内血栓的T1值平均值为(911±177)ms，小于形成时间大于一个月的陈旧性心内血栓(1169±107)ms；心内血栓的T2值两者无明显差异(73.8±7.3)ms vs (71.9±10.9)ms。目前，尚未见有关T1-mapping及T2-mapping技术在脑卒中动脉栓子MR成像方面的研究报道。

多项研究发现发病后3.0～4.5 h静脉使用重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)溶栓治疗仍然有效[5-7]，认为AIS溶栓时间窗可延长至发病4.5 h内。6 h是目前临床上使用尿激酶溶栓的时间窗[8]。根据国际惯例以“最后正常”的时间计算发病时间窗，醒后卒中的发病时间窗与正常人的睡眠时间大致相同，通常为8～12 h。因此本研究选取了血栓形成后4.5 h、6.0 h、8.0 h及12.0 h等较早期的时间点作为关键的时间点进行分析。

血栓主要由红细胞、血小板及纤维蛋白构成，各成分的构成比不同，则血栓的可溶性及硬度也大不相同。临床研究表明，血栓内红细胞含量越高，溶栓效率及血管再通率越高[9,10]。心源性栓子形成时间较长，硬度及溶栓难度较大；AS斑块破裂后局部血栓形成时间短，硬度及溶栓难度小。血栓的形成时间、成分、可溶性与临床治疗密切相关。血栓形成后不同时间点含水量会发生变化，随着红细胞萎缩脱水，纤维蛋白收缩增强，血清析出，使得血栓中的水分逐渐减少。血栓形成早期，红细胞内的血红蛋白会经历氧合血红蛋白-脱氧血红蛋白-正铁血红蛋白的变化并导致血栓MRI信号的变化。血栓形成晚期，血栓逐渐机化，由新生结缔组织、残存的纤维蛋白及细胞碎片取代红细胞、血小板及纤维蛋白，血栓MRI信号也随之发生改变[11]。

本研究是对形成时间较早(12 h以内)的血栓进行研究，发现血栓的T1值和T2值随时间推移呈逐渐下降的趋势。在该时期内血栓的含水量逐渐减少，故T1值与T2值表现为逐渐缩短。此时，红细胞内的氧合血红蛋白向脱氧血红蛋白转变，脱氧血红蛋白为顺磁性物质，能够缩短T1值与T2值。脱氧血红蛋白缩短T2值的效应较T1值显著，这可能是T2值变化的差异较T1值显著的原因。4.5 h组与6.0 h组未有明显的变化可能是由于两组之间的时间间隔较短以及实验样本量较小的缘故。

本研究仍存在一定局限性：①样本量小且只研究了12 h内血栓信号的变化；②研究对象为动物模型的血栓，跟患者的实际血栓类型存在一定差异；③仅用HE染色证实血栓的病理，没有进一步分析血栓成分。

综上所述，采用改良的凝血酶法建立兔颈总动脉血栓模型，操作简单易行，建模成功率高。MRI T1-mapping及T2-mapping技术对兔颈总动脉内血栓成像的图像质量良好，能够满足临床诊断要求，并且初步验证了定量MRI技术可以显示动脉血栓形成时间的变化。定量MRI T1-mapping及T2-mapping技术应用于醒后卒中脑动脉栓子形成时间及成分的判断具有理论及技术上的可行性，为后续研究不同时间点血栓及不同性质栓子的临床MRI评估奠定了技术基础。