李娜娜，黄志强，顾兆泰，安昕

1 广东欧谱曼迪科技有限公司，佛山市，528200

2 广东省医疗器械质量监督检验所，广州市，510663

0 引言

近年来，荧光成像技术在临床的应用逐渐广泛，为外科手术实时显示荧光剂所在的解剖结构和病灶，被认为是一种新颖的术中导航技术。其中，基于吲哚菁绿（Indocyanine Green，ICG）近红外荧光造影剂的成像技术由于穿透性深、无自发荧光背景等优势，其图像效果备受认可，近几年被广泛应用于临床血流灌注、淋巴结等解剖结构标记和病灶标记等领域[1-2]。随着大量临床研究和手术应用的普及，市场上出现的基于ICG造影剂的荧光摄像系统越来越多，如：Stryker公司的Pinpoint系统、Storz公司的IMAGE1 STM、达芬奇手术机器人加载的ICG近红外导航系统、日本滨松的PDE、上海逸思医疗的EasyscopyTM和北京数字精准医疗的慧眼系统等。生物组织的光学特性、荧光造影剂的积累和荧光摄像系统的荧光成像相关性能，如灵敏度、动态范围、信噪比和信背比等，共同决定了最终临床所呈现的荧光图像[3]。为适应特定成像系统，临床需严格控制使用造影剂的方式、时间与剂量，以保证荧光信号落在摄像系统的良好响应范围内，避免信号难以区分、图像噪声大或者信号过曝等问题。但是，目前仍没有相应的评价荧光摄像系统性能的指导或标准文件，无法进行产品性能的量化分析和质量监督。市面上产品的荧光性能亦没有统一标准，这使得造影方案需根据摄像系统反复调整，为相关临床研究和应用带来极大不便。我们提出一种荧光摄像系统的荧光性能检测标准方法，严格定义几类影响荧光图像的相关荧光性能参数，提出科学可行的检测和分析方法，并通过实例验证，旨在为荧光性能评价提供可行的标准参考。

1 关键参数设定与定义

临床应用荧光导航技术时，以不同的方式进行荧光造影剂给药，利用药品在代谢过程中的特定生物组织区域集聚进行荧光的激发成像。荧光摄像系统通常包含激发光源、荧光信号收集和荧光信号采集处理模块，使用匹配荧光造影剂吸收峰的特定波段光源进行照射激发，收集成像区域的荧光信号，过滤掉激发光及其他杂散光，进行荧光信号采集和图像处理。其中，各模块的设计和参数都严重影响所得荧光信号的质量，过多的变量使得市面产品性能不一，难以评估。在生物组织光学特性及荧光造影剂浓度确定的情况下，作为终端荧光成像设备，荧光摄像系统的信噪比、信背比、灵敏度和响应动态范围等参数至关重要，可作为评估荧光成像性能的重要标准。这些参数的标准建立、量化检测和分析，对荧光摄像系统的性能评估和临床应用的方案研究有极大的意义。

1.1 信背比

信背比（Signal-to-Background Ratio，SBR）是评价荧光图像质量的关键参数，在临床上往往与荧光检测的敏感度和检出率相关，常作为临床研究的相关终点参数[3]。特定的组织光学特性和成像设备对背景光的滤除能力，共同决定了荧光图像的背景。强度过高的背景信号将使荧光信号对比度下降，影响图像质量和临床评估。在肿瘤荧光显影中，通常将肿瘤和背景组织的荧光信号比值称为肿瘤背景比（Tumor-to-Background Ratio，TBR），有报道认为该肿瘤特异性的信号差异比值至少大于3，才可使外科医生在临床研究中区分肿瘤和正常组织[4]。

本研究以溶液样品的荧光信号和接近样品的背景信号的比值为信背比，作为评估荧光信号质量的关键参数。具体地，在荧光图像中样品孔荧光区域内，选取M个像素点，并将计算出平均亮度值作为荧光信号强度的平均值：

然后，在荧光区域附近选取无荧光背景区域中的K个像素点，并将计算出平均亮度值作为背景信号强度的平均值：

所得信背比即为：

该比值越高，代表成像设备在背景杂散光过滤方面性能越好，其荧光信号与背景差异更大，荧光显影区域如肿瘤、淋巴等，与周围背景组织的区分程度越大，越有助于区分正常组织和病变组织[3-4]。

1.2 信噪比

噪声是影响成像质量的重要因素，图像的噪声可来源于成像系统的结构性噪声和随机噪声。同等水平噪声对不同强度的信号的图像质量影响不同，以信噪比（Signal-to-Noise Ratio，SNR）评价图像质量是图像评价的常用手段，通常通过比较探测信号数值和背景噪声数值得到。从图像信号上看，信噪比的大小代表着图像信号的连续性，是区分图像有用信号和噪声的一个重要参数。

本研究以常用的方差法进行信噪比评估，即信噪比为感兴趣区域内测量信号强度的平均值和测量信号强度的标准差之间的比值[5-7]。对于图像中，Pi是有荧光标记的测量区域A中单个像素的灰度值，M为测量区域的像素数，S为测量信号强度的平均值，如下：

N为测量信号的标准差，如下：

所得信噪比即为：

信噪比越高，代表成像设备所探测信号质量越好，图像越细腻。

1.3 灵敏度与响应动态范围

特定条件下，荧光摄像系统对一定浓度范围内的造影剂荧光产生可变化信号响应，高于该浓度范围的造影剂荧光将持续呈现信号峰值响应，低于该浓度范围的造影剂荧光将保持低强度信号响应或无信号，该浓度区间即为成像系统的响应动态范围。其中，在信号质量符合要求的情况下，可探测的最低荧光剂浓度即为系统的灵敏度。摄像系统的响应动态区间应包含临床进行成像的目标荧光造影剂浓度区间，否则将无法产生与浓度相关的响应，无法体现真实的造影剂浓度情况。临床时可通过目标组织的ICG浓度来判定该位置的血流灌注是否良好以及吻合口漏等情况[8]，摄像系统的响应动态区间过小或与造影方案不适配都容易影响临床判断。其中，系统灵敏度是指荧光成像系统可达到有效成像效果的最低荧光剂浓度，影响着荧光检测的敏感性和检出率等。

在响应动态范围与灵敏度的测试中，可先通过信噪比和信背比确认信号质量，进行最低有效成像浓度的计算。具体地，可通过获取不同浓度荧光剂的图像，测量得到梯度浓度的信噪比和信背比。以信噪比SNR＞20 dB[9]为标准，符合信号质量要求为有效探测信号，在此前提下，当信背比SBR＞3[10]时，所对应的最低荧光剂浓度即为荧光系统的探测灵敏度。符合信号质量要求的最低探测浓度至系统开始呈现峰值响应的浓度区间即为系统的响应动态范围。

2 关键参数检测方法

荧光摄像系统的信噪比、信背比、灵敏度和响应动态范围等参数作为评估系统荧光成像性能的重要指标，我们为其检测和量化分析设计了科学实用的检测方法，操作流程，如图1所示。

图1 荧光摄像系统的性能检测流程图Fig.1 Flow chart of the performance detection of fluorescence imaging system

2.1 测试样品盘

本研究为了科学评估荧光成像系统，设计一个标准的荧光试剂样品盘，以统一不同成像系统的测试条件。如图2所示，样品盘四个角落直径为5 mm的半圆凹坑ABCD/abcd，作为盛载高浓度荧光剂的视野定位孔，用于荧光成像时保持成像系统所观察的视场一致。其中，ABCD四个视野定位孔对16:9成像画面，abcd视野定位孔针对4:3画面。样品盘中间区域设置圆形排列直径为10 mm的半圆凹坑，作为盛载测量所用的不同浓度荧光剂的测试样品孔，使测试样品处于视野中央，保持照明角度一致，避免测试时产生偏差。样品盘采用白色PVC塑料加工而成，其效果如图2样品盘实物图所示。

图2 荧光试剂样品盘示意图及实物图Fig.2 Schematic diagram and physical product of the fluorescent agent sample disk

2.2 预测试与荧光剂配制

此处以吲哚菁绿作荧光剂为例，进行荧光摄像系统探测样品的配制。称取一定量的吲哚菁绿粉末，用去离子水充分溶解，作为母液。由于不同荧光摄像系统的性能差异可能较大，可先使用血清稀释上述吲哚菁绿溶液，于离心管内配制不同浓度溶液，使用待测设备进行成像，作为预测试，为选择探测溶液浓度提供参考。预测试中，随着溶液浓度增加，荧光信号将逐渐增强，最终呈现过曝现象。根据预测试结果，选择溶液荧光信号过曝的临界点附近的浓度作为测试样品的1号溶液，使用血清稀释1号溶液，以2倍为稀释梯度，制备12管探测溶液。

本次实验案例以欧谱曼迪科技有限公司研制的ICG荧光导航系统作为测试设备，预测试结果显示62.50 nM溶液为荧光信号过曝的临界点附近的浓度，以其为1号溶液进行稀释，具体见表1。

2.3 测试方法与数据处理

将250 μL的ICG荧光溶剂按顺序滴加入样品盘的测试样品孔中，保持液面与样品盘持平，并将较高浓度探测液滴加入四个角落的视野定位孔中。调整待测设备的观察距离和位置，使得样品盘四个角落的视野定位孔正好完全进入视场。保存图片，使用软件ImageJ进行分析。如图3所示，通过软件区域选取功能，选取荧光区域和最接近荧光的背景区域，作为荧光信号区域和背景信号区域，进行平均值和标准差分析，通过1节中所述关键参数设定公式得到信噪比、信背比、动态响应区间和设备灵敏度数据。

图3 荧光信号区域和背景信号区域的选取Fig.3 Selections of fluorescence signal region and background signal region

2.4 材料与设备

本次测试采用欧谱曼迪科技有限公司研制的ICG荧光导航系统作为测试设备，该设备具有白光成像和近红外荧光导航成像功能。测试使用荧光剂吲哚菁绿（CAS 号：3599-32-4，美仑生物，MB4675），小牛血清（Cat 号:SNCS，bovogen，Lot No:1602D）。

3 检测结果与分析

按照所述方法配制不同浓度荧光剂后滴入样品孔后进行成像。此处以欧谱曼迪科技有限公司的ICG荧光导航系统为待探测仪器，其图像展示长宽比为4:3，选取样品盘abcd小孔作为视野定位孔，滴入高浓度荧光剂。测试仪器时保持abcd视野定位孔恰好位于视野边角，保存成像图片以供数据分析。

实验所得图像如图4所示，高浓度样品孔的荧光信号呈现过曝状态，浓度最低的三个样品孔（10～12号溶液）无肉眼可分辨的信号，可能超出设备的动态响应范围。实验通过2.3中所述方法对样品荧光信号进行数据分析，未从浓度最低的10～12号溶液中测得可分辨信号，其他样品孔信号如图5（a）所示。从图5（a）中可看出，随着荧光剂浓度的增加，荧光强度逐渐增加，在浓度为31.25 nM的2号溶液信号灰度值开始达到254，进入峰值响应的过曝平台区间。对各样品孔的信背比SBR进行分析发现，随着样品浓度升高，SBR呈现先上升后下降的趋势，在低浓度区间，荧光信号较暗，与背景信号对比度不高；而在高浓度区间，较亮的荧光信号容易在周围物体产生反射光，导致背景信号的上升，SBR下降。但从图5（b）中可发现，1～9号样品的SBR均高于最低标准3，不影响临床辨别。在图像信噪比SNR的分析中可见，随着样品浓度上升，SNR逐渐上升，其中8～9号低浓度样品的SNR低于最低标准20，信号质量不符合要求，视为无效探测信号。综上，在SBR＞3和SNR＞20 dB的条件下，可探测的最低浓度为7号样品，即0.98 nM，为所测系统的灵敏度。所测系统在样品浓度高至31.25 nM时开始出现峰值响应，其响应动态范围为0.98～31.25 nM。

表1 荧光剂溶液梯度表Tab.1 Concentration gradient of the fluorescence agent solution

图4 待测仪器成像效果图（白光图像，荧光图像）Fig.4 Imaging results of the equipment under test(the white-light image and the fluorescence image)

图5 样品参数图Fig.5 Parmenter figures of samples

4 结论

本研究提出一种评估荧光摄像系统的标准方法，通过制定标准化测试样品获取待测系统的整体图像，建立科学实用的信噪比、信背比、灵敏度和响应动态范围等参数的量化分析标准，对荧光摄像系统性能进行评估，旨在为相关产品性能的量化分析和质量监督提供切实可行的标准参考，同时也为临床使用和应用研究的图像效果提供保障，促进荧光摄像系统在临床上的广泛应用。