陈斯文 李思放 陈雅南 祁少海 陈 蕾*

(1.中山大学附属第一医院脊柱外科，广东 广州 510080；2.中山大学中山医学院 临床医学系，广东 广州 510080；3.中山大学附属第一医院烧伤外科，广东 广州 510080)

各种原因造成的皮肤损伤若波及真皮，修复后易形成瘢痕，不仅会影响外观、功能，还可导致肢体畸形，给患者及其家人带来沉重的心理和经济负担。如何促进此类创面愈合并提高修复质量是组织工程学研究的重点。组织工程真皮是一种真皮等同物，对创面起覆盖保护、防止体液流失等作用之外，还能诱导细胞迁入增殖，为真皮组织再生性修复提供支撑。人源性异体脱细胞真皮经脱细胞处理后免疫原性降低，是真皮缺损修复的理想材料，但该产品存在着传播疾病的潜在危险(如艾滋病)，且随着器官移植规范化的推进，来源日益紧张，不能满足临床的需要。组织工程真皮产品的研发为改善创面修复质量，解决皮源紧张提供新的途径。目前，国外研究者已成功地开发出出多款组织工程真皮，初步应用于深度烧伤、糖尿病相关创面的修复及瘢痕整形手术。为了促进组织工程真皮的研发及临床转化，建立皮肤创面修复动物模型具有重要意义。

猪的解剖结构和生理状态与人十分类似。与大型猪种相比，小型猪体型小、操作方便、易于饲养、饲养费用低、基因纯度较高。作为实验动物在皮肤、烧伤等领域具明显应用优势。

1 小型猪的皮肤特点

小型猪(以巴马小型猪为例)的皮肤结构与人皮肤结构一样，表皮层自内向外依次为由基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层组成，而真皮层则由乳头层和网织层构成。表皮中最底层为基底层，附着于基膜上，由一层矮柱状基底细胞组成。棘层由4～10层多边形，体积较大的棘细胞组成。颗粒层由1～2层梭形细胞组成。透明层由多层无胞核和细胞器组成。皮肤最外层为角质层，由多层扁平的，无细胞核和细胞器的角化细胞构成。而真皮靠近表皮的为乳头层，结构致密，含丰富的毛细血管，有真皮乳头和表皮皮钉相互连接，结构与人皮肤极为相似。内层网织层较厚，内有交织成网的胶原纤维和许多弹性纤维以及较多血管、淋巴管、皮脂腺、汗腺和神经。两层交接处有许多水平走向的浅表小静脉和小动脉从，伸出许多垂直毛细血管营养真皮和表皮。此外，巴马香猪皮肤真皮基质的构成成和分布也和人类皮肤极其类似，主要由胶原纤维、弹力纤维及网状纤维构成，但巴马香猪皮肤真皮层中弹力纤维明显比人类皮肤中的弹力纤维含量少。值得注意的是，猪的皮肤真皮基质中广泛分布有Langerhans cells等具有免疫活性的细胞2。

巴马香猪皮肤与人皮肤之间亦存在差异。首先，巴马香猪皮肤中的汗腺与其它猪种一样，是顶泌汗腺，分布于真皮和脂肪相接的真皮深层，在颏部、蹄间、包皮开口及乳腺外周较多、分泌物通过接近于毛囊的开口排放于体外3，不能调节体温；而人类则主要是外泌汗腺，只有特殊部位才有顶泌汗腺，人类的汗腺主要起调节体温的作用。其次，巴马香猪皮肤中的很多物质仍然缺乏与人类相对应的抗原决定簇，与相对应的人抗血清之间没有交叉反应4。

2 小型猪皮肤创面愈合特点

验证组织工程真皮类材料所用的创面多采用锐性啮齿类动物如SD大鼠、小鼠由于皮下结缔组织疏松，主要是通过收缩伤口而达到修复创伤目的5。而小型猪的皮肤创面愈合主要是通过创面组织再生及上皮化来完成，过程与人类似。因此，选用小型猪作为组织工程真皮治疗效能验证的载体更具科学性。

3 目前猪在皮肤组织工程中的应用

Yanfu Han6等利用表达VEGF的人脐带系间叶基质细胞与经激光打孔的无细胞真皮基质构建组织工程真皮，并将此真支架植入全层皮肤切除的迷你猪创面上。以此来为构建一种新型的皮肤组织工程材料建立构想。Daegu Son7等选用Yorkshire猪来探究皮下脂肪对皮肤移植存活基质的影响并证明皮下脂肪的存在对皮肤真皮血管再生有正性作用，并发现一种新的皮肤生长机制。Elizabeth Kiwanuka8等也是选用yorkshire猪来比较skin micrografts，断层皮片，自体角质细胞对创面愈合的治疗效能。并得出MV与断层皮片相对于无材料覆盖和自体角质细胞来说，均对皮肤移植有利的结论。

4 猪创面修复模型的构建

4.1 猪品系的选择

目前国内可供选择的猪有巴马小型猪，五指山小型猪、贵州小型香猪、藏猪、西双版纳微型猪、广西巴马小型猪等9。其中，五指山小型猪是我国小型猪中体型最小、体重最轻的品种之一，具有体型小、遗传稳定，抗逆性强等优势。但其毛色为黑色，对皮肤愈合情况的观察有一定影响。贵州小型香猪体型小，品种纯。藏猪有生命力强和抗逆性强等优点；版纳微型猪近交系数较高，体型矮小，生长缓慢。巴马小型猪具有遗传稳定，体重较小，除头部和尾部外，身上绝大部分及毛发为白色，实验观察较为方便等优点10。在实验猪的选择上，可根据特定的实验目的来选择具体的品系。

目前国内在皮肤创面愈合试验中选用较多的猪种为巴马小型猪和五指山小型猪。而国外选择较多的为约克猪，此种猪毛色为白色，体型适中，但国内不常用，故不作过多叙述。此外，在猪的年龄选择方面，通过Federico Solla11等在新生猪身上做同种异体皮肤移植的实验发现，年龄过小的猪在免疫耐受方面发育未成熟，易出现排斥反应，因此建议此类实验应在体重在2kg以上，出生6天以后的猪身上进行。

4.2 皮肤创面修复模型的构建

4.2.1 除毛

除毛建议选择用电动剃毛刀或者剃须刀，尽量不用脱毛膏，避免脱毛膏刺激皮肤引起皮肤红热等现象影响实验观察。

4.2.2 消毒

可选用碘仿等消毒剂消毒，不宜选择刺激性较强的消毒剂消毒。

4.2.3 标记和制造创面

可选用马克笔或者“纹身”的方式对创缘进行12标记，后者可在猪皮肤长期保留以便观察创面收缩情况。创面形状可为圆形或方形，面积从4cm2到25cm2，依实验需要和猪的皮肤面积而不同，创面间间隔一般设为2cm以上7，11，13。制造的创面深度宜不超过肌肉表面深筋膜，实际深度依实验要求和猪皮肤厚度而定，如E.Middelkoop1等在建立真皮替代物动物模型时采用20kg的雌性约克猪，取皮深度为2.7mm。

4.2.4 取皮及组织工程真皮植入

取皮方法目前主要有两种，一种为手术刀取皮7，另一种为电动取皮刀取皮12。手术刀取皮操作简单，但取皮的厚度不均匀且较为费时。电动取皮刀能获取厚度均匀(平均能取到0.20～0.30mm的厚度)且更薄的断层皮片，操作时间短，但对研究者的手术操作能力要求较高。

4.2.5 缝合及包扎

猪有喜欢磨蹭皮肤的习性，因此创面的保护必不可少。目前，较为常用的方案是采用透气、有弹性的粘性绷带(Curafix® Lohmann & Rauscher，Neuwied，Germany)和弹性包扎套(Tubigrip)1对实验猪进行加压包扎14。操作时需要避免包扎过紧影响猪的呼吸、活动和正常进食。

5 猪创面修复质量的评估

5.1 造模后观察与取材

造模后，如有需要可采用注射镇痛药的方式减轻动物的痛苦。有文献报道，术后连续注射阿司匹林(10mg/kg)5天可有效缓解动物的术后疼痛15。

操作者可在设定的观察时间点选用手术刀或Punch biopsies的方法获取组织。前者取材面积广，后者所获组织为直径小于10mm的固定圆柱形，操作便捷14。必要时，需要将创面组织及其周围的正常皮肤、皮下组织一同取下，便于对比观察。

5.2 创面愈合质量的常用检测手段

组织工程真皮材料在实际应用时常需与自体断层皮片结合、一期手术移植修复受体创面。其体内验证是否成功可通过评估自体断层皮片移植成活效果，创面床血管再生、炎症细胞浸润、纤维化程度，材料降解情况等而判断12。下面，作者列举一些常用的检测方法供实验者参考。

5.2.1 数字化平面几何法

通过描绘创面大小，并用scion image software等软件进行分析，得出创面的收缩数据8。

5.2.2 病理染色

最常用的染色方式包括苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)和Masson染色，前者主要用于固定组织基本形貌观察，后者主要用于评估组织内的胶原沉积(纤维化)情况8。为了对标本组织血管化、炎症浸润及瘢痕形成状况进行突出显示和重点评估，研究者还引入了免疫组织化学技术。就研究者通常关注的局部血管化和炎症水平评估来说，目前常用的检测抗体有人血管内皮生长因子(human vascular endothelial growth factor，hVEGF)、血管性血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)14、白细胞分化抗原31(Cluster of Differentiation 31，CD31)和CD34(CD34是所有新生小血管内皮细胞表达的一种特异性抗原，也表达于造血干细胞表面，故可用于标记新生小血管和造血干细胞16)。炎症水平评估方面，除了经常使用白细胞分化抗原68(Cluster of Differentiation 68，CD68)等抗体来标记巨噬细胞等在皮肤创面修复中扮演重要角色的免疫细胞以外，还可检测白介素10(Interleukin 10，IL-10)(一种抗炎症反应细胞因子，能减弱中性粒细胞和巨噬细胞的作用。其表达增高说明机体调节性地控制炎症反应的进行，保证炎症反应不过表达，减少炎症反应对机体组织的损害17)、C-X-C型趋化因子配体2(CXC motif chemokine ligand 2，CXCL2)(由单核细胞和巨噬细胞分泌产生，具有趋化作用。其通过提高基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)的水平募集中性粒细胞和造血干细胞18。此蛋白的表达与炎症反应程度呈正相关)等炎症相关因子的表达水平。

5.2.3 基因表达情况分析

目前，与猪相关的研究试剂较少，在进行免疫组化等需抗原抗体反应参与的检测时困难较大。此时，研究者也可通过核酸检测技术对创面修复情况进行评估。α1-I型胶原基因(collagen，type I，alpha 1，COL1a1)、COL1a2、COL3a1、COL5a2、腱糖蛋白C(Tenascin-C，TNC)19，20等是常见检测细胞外基质的基因。其他还有重构酶(基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、MMP-9、组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator，t-PA)、尿激酶型纤溶酶原激活物(urinary-type plasminogen activator，u-PA)、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(plasminogen activator urokinase receptor，PLAUR)等)表达水平，炎症相关细胞因子(C-C型趋化因子配体2(C-C motif chemokine ligand 2，CCL2)、CXCL2、IL-10)和生长因子(成纤维细胞生长因子7(fibroblast growth factor 7，FGF7)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、Smad蛋白-3(Smad3))、信号传导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription，STAT3)、转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGFB1)、TGFB2、TGFB319，21，22-25)的表达以及WNT信号通路的检测26，27。

5.2.4 激光共聚焦显微镜观察

通过激光共聚焦显微镜对已作荧光标记的组织切片进行观察，并利用计算机进行图像处理，得出细胞或组织内部微细结构的荧光图像。除此之外，对较厚的组织切片进行连续扫描，再经过计算机图像处理，可形成完整的三维图像，以此获得较完整的皮肤结构图像13。

5.2.5 X光

为能够直观的观察血管的再生情况和走向，可拍摄X光片来观察，步骤如下：在动物处于麻醉的状态下，静脉注射麻药加肝素使血管扩张，随后注射生理盐水与造影剂替代全身血液，最后拍摄X光照片以看血管再生情况7。

5.2.6 多普勒血流检测

多普勒血流检测仪可发射激光达皮下1到1.5mm的深度，此深度的结构为真皮乳头环内的小动脉，毛细血管，毛细血管后小静脉以及表面的水平走向的小血管28。运用多普勒血流检测恩典方法可了解活体情况下动物皮肤的血管再生以及血流的情况。

进行直观的观察6。

6 结论

目前，国内可用于组织工程真皮体内验证的小型猪品种较多，皮肤结构、生理功能、免疫及创面愈合过程与人类接近，适用于检测组织工程真皮。本文回顾了国内外现有猪皮肤移植模型的构建方法并对其评价指标进行复习。以求供研者根据不同的实验目的进行选择，助力于组织工程真皮的研发及转化应用。