付建鑫，邵家威，张炳文，方奕珊，张桂香*

（1.济南大学食品科学与营养系，山东济南 250002；2.齐鲁工业大学食品科学与工程，山东济南 250353）

近年来，岸基湿地、滩涂等土壤盐渍化现象日益严重，耕地土壤土质硬化，耕地资源紧缺，迫使人们不得不考虑开发利用盐生植物资源，所以研究及推广盐生植物的种植势在必行。灰绿碱蓬（Bunge）又名黄须菜，是一年生藜科碱蓬属草本盐生植物，多生长于滩涂及荒漠处，是盐碱地的特征植物[1-2]。碱蓬在我国不仅分布广泛，而且产量高。据统计，每年仅黄河三角洲地区的碱蓬产量就高达3.3105t[3-4]。碱蓬茎、叶含有丰富的矿物质、黄酮、皂苷，其种籽中含有大量的共轭亚油酸、花生四烯酸等不饱和脂肪酸[5-6]。医学研究发现，碱蓬提取物中的黄酮、多糖具有抗氧化、降低血浆胆固醇功能，可用于心脑血管疾病的预防及中老年人的保健；其芽、叶分离物具有抑菌消炎等功效[7]，因此具有很高的研究价值。

目前国内外关于碱蓬的研究主要着眼于盐地碱蓬、硬翅碱蓬的耐盐机理研究及活性物质提取等方面[8]，对灰绿碱蓬多糖的提取、纯化等的研究鲜见报道。蛋白本身具有热敏感性，糖蛋白复合物在脱除蛋白质以后，多糖自身生物活性会明显增加，因此，关于多糖脱蛋白的研究成为热点。鉴于此，本研究以灰绿碱蓬为研究对象，测定了根、茎、叶及全株的基本营养成分并对灰绿碱蓬多糖的脱蛋白方式进行了探究。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

灰绿碱蓬，采自山东东营；碱性蛋白酶，国药集团化学试剂有限公司；石油醚、无水乙醇、硫酸铜、氢氧化钠、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、氨水、TCA、(NH4)2SO4等试剂，均为分析纯。

702A 紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；PHS-3B pH 酸度计，赛多普利斯科学仪器有限公司；FA2004N 电子天平，上海上平仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 灰绿碱蓬基本成分的测定

蛋白质含量测定，按GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》执行；总糖含量测定，按GB/T 15672-2009《食品安全国家标准 食用菌中总糖含量的测定》执行；脂肪含量测定，按GB 5009.6-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》执行；黄酮含量测定，按GB/T 20574-2006《蜂胶中总黄酮含量的测定方法分光光度比色法》执行；皂苷含量测定，按GB/T 22464-2008《大豆皂苷》执行。

1.2.2 灰绿碱蓬多糖提取工艺

通过溶剂浸提法去除植株少量脂肪及大量可溶性色素[8-9]。过量正己烷回流脱脂4～6 h，将脱脂后的索式提取系统用少量水冲洗，以75%乙醇为溶剂进行色素冲洗，直至提取管内无颜色变化为止。称量单位质量已处理的碱蓬干粉（200 目）于烧杯中，加入一定量的沸水，封膜密闭后于超声清洗器中浸提。将冷却沉降后的提取上清液在8 000 r/min 条件下离心10 min，取离心后的上清液旋转蒸发浓缩，得到粗多糖提取液。400 mL 无水乙醇按照4:1（V/V）的比例缓慢倒入100 mL 粗多糖提取液中，并搅拌均匀，放置于4条件下冷藏，每隔3 h 搅拌一次，沉淀过夜后，倾倒上层清液。下层溶液在7 000 r/min 离心12 min 后，将沉淀用无水乙醇和石油醚洗涤多次后过HZ-800 大孔树脂脱色，收集脱色后溶液冷冻干燥，即为碱蓬粗多糖。

1.2.3 多糖脱蛋白工艺

（1）TCA 脱蛋白

TCA 属于有机弱酸类，它可以改变溶液体系中pH使其呈酸性，溶液中悬浮蛋白质在酸性条件下变性形成沉淀析出，蛋白质析出速度和脱除率与TCA 浓度直接相关[15]。将100 mL、10 mg/mL 脱色后的碱蓬多糖溶液按照1%、3%、7%、10%、15%的比例与30%粗多糖提取液（V/V）混合，搅拌30 min 后于200 W 功率下超声10 min，用0.1 mol/LNaOH 调节pH 至7.8，使蛋白质沉淀，再以7 000 r/min 离心10 min，取上清液测定蛋白质含量，确定TCA 脱蛋白的效果及最佳条件[10]。

（2）Savage 脱蛋白

四氯化碳溶液又称氯仿，具有极强的破坏作用，可以使蛋白质急剧变性，正丁醇可以溶解变性蛋白形成凝胶体体系利于分层。按照1:4（V/V）的比例将氯仿（CCl4）与正丁醇复配成Savage 溶剂，按照5:1（V/V）的比例将复配溶剂与脱色后的多糖溶液混合振荡，并以1.5104r/min破碎机高速搅拌，移入分液漏斗后静置分层，测定5 次脱蛋白的效果，确定Savage 脱蛋白法的效果及最佳脱蛋白次数[11]。

（3）(NH4)SO4沉淀法

蛋白质盐析（salting out）是指溶液体系中的蛋白质随着外源中性盐（硫酸铵、氯化铵等）的加入而逐渐析出的现象。盐溶液是强电解质，在溶液中完全电离，具有较高的溶解度。盐离子会附着蛋白质表面的水膜争夺水分子破坏水膜结构。另一方面，阴离子如Cl-可以结合蛋白质表面的，从而使蛋白质颗粒团聚形成沉淀析出。取100 mL、10 mg/mL 脱色后的灰绿碱蓬多糖溶液，用0.1 mol/L 的氨水溶液调节pH 至8.3 左右，按照1%、3%、7%、10%、15%的比例加入5 mol/L 的(NH4)SO4溶液，封口膜封闭锥形瓶口，剧烈振荡后于85的水浴条件下保持40 min。反应完毕后，静置到室温，10 000 r/min 离心10 min，取上清液测定蛋白质含量，探究(NH4)SO4的最佳浓度[12]。

（4）酶-Savage 法

取100 mL、10 mg/mL 脱色后的灰绿碱蓬多糖溶液，按照1%、3%、7%、10%、15%比例加入碱性蛋白酶（按照每100 mL 溶液104U），使用0.1 mol/L NaOH 调节pH 至7.5，在37水浴保持3.5 h，反应完毕后在100水浴灭酶15 min，10 000 r/min 离心10 min，上清液再按照（2）所述操作1 次，取上清液测定蛋白质含量，确定最佳酶添加量[13]。

1.2.4 考马斯亮蓝法测定蛋白含量

（1）多糖溶液的配制

取碱蓬粗多糖用蒸馏水配置成10 mg/mL 粗多糖溶液，充分溶解后冷藏、静置备用[14]。

（2）考马斯亮蓝G-250 的配制

取0.1 g G-250 溶于50 mL、85%无水乙醇中，超声充分溶解，2 000 r/min 离心10 min，取上清液与100 mL、85%（w/V）的磷酸混合，用去离子水定容至1 L。

按照表1 依次加入溶剂，混合均匀后，取0.1 mL加入5 mL G-250 摇匀室温反应10 min，595 nm 条件下测定吸光值，用去离子水做空白对照，制作标准曲线。

表1 标准曲线试剂量Table 1 The amount reagent of standard curve

蛋白质脱除率计算公式见式（1）。

2 结果与分析

2.1 灰绿碱蓬物质成分含量

表2 灰绿碱蓬物质成分含量Table 2 The content of each substance

2.2 碱蓬多糖脱蛋白的方法比较

2.2.1 TCA 脱蛋白的效果

图2（见下页）显示了TCA 脱蛋白效果。由图2 可知，随着TCA 含量增加，脱除率呈拟线性增加，说明蛋白质脱除率逐渐增大，溶液中蛋白质含量逐渐减少。蛋白质脱除趋势可以看出蛋白质的脱除效果对三氯乙酸呈现剂量依赖效应，在达到TCA 饱和浓度前，游离蛋白和结合蛋白会随着TCA 增加而减少。除此之外，三氯乙酸也可能破坏糖苷键分解糖蛋白，因此10%TCA 用量效果最佳。

对于女性的上述角色定位及德性要求与儒家所建构的秩序体系是内在一体的。在儒家而言，“男女之别”只是人伦之起点，其目的在于建立“父子亲”“君臣义”的等差性社会秩序。因而尽管人们认为女性通常被限定于“内”和“私”的领域之中而无缘于公共事务，但实际上，儒家女性是被裹挟于家族与政治的“公”之中并为“公”服务的。从公私观上考察，可以清晰地看出其逻辑线索。

2.2.2 Savage 脱蛋白的效果

图3 显示了Savage 脱蛋白的效果，由图可知，随着脱蛋白次数的增加，蛋白质脱除率明显增大，脱蛋白次数为4 次时，蛋白质含量趋于稳定，此时蛋白质脱除率达到最大，为89.14%。李小荣等[16]对倒卵叶五加多糖脱蛋白结论中，Savage 法脱蛋白为5 次时，蛋白质最佳脱除率为80.32%；对蒲公英多糖脱蛋白效果研究中发现，相同方法处理6 次，蛋白质脱除率稳定在80.21%[17]。整体来看，Savage 法具有较好的脱蛋白能力和普适性，灰绿碱蓬多糖Savage 法脱蛋白处理4 次较好。

2.2.3 (NH4)2SO4沉淀法脱蛋白的效果

图4 显示了(NH4)2SO4脱蛋白效果。如图4 所示，随着(NH4)2SO4浓度增大，蛋白脱除率增大，蛋白盐析形成沉淀，溶液中蛋白质含量逐渐减少。盐析法主要针对游离蛋白质颗粒，同时(NH4)2SO4浓度对盐析效果存在较大影响，高浓度盐溶液与体系存在浓度差，因此脱蛋白效果较好。(NH4)2SO4浓度为10%时，蛋白质脱除率最高为15.36%。

2.2.4 酶-Savage 法脱蛋白的效果

2.3 脱蛋白方式的选择

选取最佳脱蛋白方式主要考虑蛋白质脱除率和多糖保留率两个指标，以多糖为研究目标，脱除游离蛋白及糖蛋白可以更好地测定多糖的生物活性。如表3 可知，TCA法和盐析法蛋白质脱除率分别为38.43%、14.24%，蛋白质脱除率较低，无法得到高纯度的多糖。比较Savage 法和酶-Savage 法，两种脱蛋白工艺的都具有较好的蛋白质脱除效果，除此之外，酶-Savage 法的多糖保留率高于Savage 法，在酶添加量7%、Savage 溶液处理一次，此时多糖保留率达到67.27%。因此，灰绿碱蓬多糖最佳脱蛋白方法为酶-Savage 法。

表3 脱蛋白效果与多糖保留率/%Table 3 Deproteinization effect and polysaccharide retention rate/%

3 结论

通过测定灰绿碱蓬根、茎、叶的基本营养物质成分，发现全植株水分含量较高而脂肪含量极少，含有部分蛋白质，叶片中的总黄酮、总皂苷和总糖含量最多。在脱蛋白研究中，比较了Savage 法、盐析法、TCA 法和酶-Savage 法脱蛋白效果。考虑到最低溶剂使用量和脱蛋白效果最优，选择酶-Savage 法作为灰绿碱蓬多糖的脱蛋白方式，酶添加量为7%，Savage 溶液处理一次蛋白质脱除率80.71%，多糖保留率为67.27%，此时脱蛋白效果和多糖保留率最好。