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Hedgehog通路在缺氧诱导脑胶质瘤转移中的作用及分子机制研究

2020-02-22傅之梅胡兵伟王钱东马婷婷

中国现代医生 2020年32期
关键词:胶质瘤抑制剂通路

傅之梅 胡兵伟 王钱东 马婷婷

[摘要] 目的 探討Hedgehog通路在缺氧诱导脑胶质瘤转移中的作用及分子机制。 方法 选择2018年1月~2019年8月浙江省立同德医院脑胶质瘤患者5例,取其脑胶质瘤细胞,随机分为对照组、抑制剂处理组、乏氧组和乏氧加抑制剂处理组。各组细胞均完成48 h培养,采用Westernblot检测各组细胞Smoothened(SMO)、神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白1(GLI1)和上皮间质转化(EMT)E-cadherin基因表达,采用BrdU-ELISA法检测细胞增殖,采用Transwell法检测细胞侵袭作用。 结果 Westernblot检测结果显示,乏氧加抑制剂处理组SMO、GLI1及EMT相关蛋白表达水平低于乏氧组、抑制剂处理组与对照组(P<0.05);乏氧组SMO、GLI1及EMT相关蛋白表达水平高于抑制剂处理组与对照组(P<0.05)。BrdU-ELISA法结果显示,乏氧加抑制剂处理组不同时间点细胞增殖率低于乏氧组,高于抑制剂处理组与对照组(P<0.05)。Transwell法检测结果显示,乏氧加抑制剂处理组细胞侵袭率低于乏氧组,但明显高于抑制剂处理组与对照组(P<0.05);乏氧组细胞侵袭率高于抑制剂处理组与对照组(P<0.05)。 结论 Hedgehog通路可能通过SMO、GLI1调控EMT,参与疾病的发生、发展,在缺氧诱导脑胶质瘤转移中发挥重要的作用,能为脑胶质瘤转移治疗提供新的靶点。

[关键词] Hedgehog通路;Smoothened;神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白1;上皮间质转化;缺氧诱导;脑胶质瘤转移

[中图分类号] R739.41          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701(2020)32-0020-04

[Abstract] Objective To explore the role and molecular mechanism of Hedgehog pathway in hypoxia-induced glioma metastasis. Methods From January 2018 to August 2019, a total of 5 patients with glioma from Tongde Hospital of Zhejiang Province were selected as subjects. Glioma cells were collected and randomly divided into a control group, an inhibitor-treated group, a hypoxia group, and a hypoxia combined with inhibitor-treated group. The cells in each group were given 48 hours of culture. The expression of Smoothened(SMO), glioma-associated oncogene homologous protein 1(GLI1) and epithelial mesenchymal transformation(EMT) E-cadherin genes were detected by Westernblot, cell proliferation was detected by BrdU-ELISA method, and cell invasion was detected by Transwell method. Results Westernblot test results showed that the expression levels of SMO, GLI1 and EMT-related proteins in the hypoxia combined with inhibitor-treated group were lower than those in the hypoxia group, inhibitor-treated group and control group(P<0.05); the expression levels of SMO, GLI1 and EMT-related proteins in the hypoxia group were higher than those in the inhibitor-treated group and the control group(P<0.05); the results of BrdU-ELISA showed that the cell proliferation rate in the hypoxia combined with inhibitor-treated group at different time points was lower than that in the hypoxia group, but was higher than that in the inhibitor-treated group and control group(P<0.05); Transwell test results showed that the cell invasion rate in the hypoxia combined with inhibitor-treated group was lower than that in the hypoxia group, but was significantly higher than that in the inhibitor-treated group and control group(P<0.05); the cell invasion rate in the hypoxia group was higher than that in the inhibitor-treated group and control group(P<0.05). Conclusion Hedgehog pathway may participate in the occurrence and development of EMT through SMO and GLI1 regulations, which play important roles in hypoxia-induced glioma metastasis and can provide a new target for the treatment of glioma metastasis.

[Key words] Hedgehog pathway; Smoothened; Glioma-associated oncogene homologous protein 1; Epithelial mesenchymal transformation; Hypoxia-induced; Glioma metastasis

胶质瘤是临床常见的恶性肿瘤,在中枢神经系统肿瘤中较为常见,占颅脑肿瘤的35.26%~60.96%,其发病率占脑肿瘤首位,死亡率居第二位[1]。由于胶质瘤具有高浸润生长的生物学特性,导致手术无法保证肿瘤的完全切除,术后复发率近90.0%,且随着手术次数、复发次数的增加,恶性程度具有增加趋势。缺氧是肿瘤微环境的基本特征之一,能促进肿瘤侵袭和转移作用[2-3]。临床研究显示,介导缺氧应答的主要转录因子-缺氧诱导因子1α(HIF-α)在脑胶质瘤等多种肿瘤中过表达,且与脑胶质瘤的转移、预后有关[4-5]。上皮间质转化(EMT)是将具有极性的上皮细胞转换成具有活性能力、能在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程[6]。Suh[7]的研究表明,Hedgehog通路中的锌指转录因子GLI1及上游转膜蛋白SMO亦是上述缺氧/JDAC3调节的靶基因,哺乳动物Hedgehog通路由三种HH配体激发,能与受体转膜蛋白Patched1(PTCH1)结合,从而阻断PTCH1对转膜蛋白SMO的抑制功能,释放SMO活性,实现下游靶基因的调控作用[8-9]。因此,本研究以脑胶质瘤细胞为研究对象,探讨Hedgehog通路在缺氧诱导脑胶质瘤转移中的作用及分子机制,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年1月~2019年8月浙江省立同德医院脑胶质瘤患者5例。取其脑胶质瘤细胞,随机均分为对照组、抑制剂处理组、乏氧组和乏氧加抑制剂处理组。本研究经医院医学伦理委员会批准,所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 材料与设备  胎牛血清RMPI-1640培养基(美国HyClone公司)、小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、Transwell小室(美国Becton Dickinson)、人工基质胶Mateigel(美国Becton Dickinson)、青/链霉素,RIPA裂解液、BCA法蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司)。

1.2.2 细胞处理[10-11]  取脑胶质瘤细胞,将细胞接种在浓度为10.0%的胎牛血清RMPI-1640培养基中,放置在37℃、浓度为5%的CO2细胞培养箱中培养,待细胞融合80.0%以上时,开始传代培养。培养前去除原培养液,并利用PBS缓冲液连续进行2次漂洗。向获得的溶液中加入浓度为0.25%的胰蛋白酶消化液进行消化,倒置显微镜下观察细胞形态,待细胞回缩、变圆后,将消化液吸出,并加入完全培养液终止消化。利用吸管反复、轻柔吹打培养瓶底,使细胞充分脱离瓶壁。取细胞悬液15 mL放置在离心管中,连续进行8 min离心,离心速度1000 rpm,去除上清液;向获得的细胞悬液中加入完全培养基重悬细胞,以1∶2进行传代培养,每3天换液一次,待细胞融合90.0%时再次传代,取第三代对数生长的细胞,将其随机分装在不同的试管中进行分组。对照组不采取任何措施处理及干预,向细胞中加入培养基进行常规培养,连续完成48 h培养;抑制剂处理组在常规培养24 h后加入SANT1、GANT61处理48 h;乏氧组在收细胞前24 h由常规培养改为低氧(1%O2)培养,连续完成48 h培养;乏氧加抑制剂处理组在低氧培养24 h后加抑制剂处理48 h。各组细胞处理后放置在培养箱中进行培养,培养箱为37℃、5%CO2、饱和湿度[12]。

1.2.3 检测方法  (1)典型基因标志表达:采用Western blot检测各组细胞Smoothened(SMO)、神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白1(GLI1)和上皮间质转化(EMT)标志蛋白E-cadherin表达[13]。具体步骤包括:①蛋白质的提取;②蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳;③蛋白质转印;④封闭;⑤一抗、二抗孵育;⑥显影。将最终处理后的PVDF膜,以β-actin作为内参物,根据正确的位置、方法放置在发光板(蛋白面板)上,并加入少许发光液,选择合适的曝光条件,完成显影并保存。(2)细胞增殖:采用BrdU-ELISA法检测细胞增殖。取各组干预后12、24、36及48 h的细胞,以20 000/孔培养在96孔细胞培养板中,以梯度浓度CWE完成72 h处理,根据BrdU试剂盒说明,完成细胞的固定、冲洗,加入相应的抗体、洗涤后显色,在微孔板分光光度计上以450 nm波长度数进行测定[14]。(3)细胞侵袭能力:采用Transwell法检测细胞侵袭能力。取各组干预后的细胞,以1×105个/孔的密度接种在24孔板Transwell中,每孔中设置复孔5个,并且在上室加入200 μL DMEM∶F12培养基、下室加入600 μL DMEM∶F12培养基,并在37℃细胞培养箱中连续完成48 h培养,吸取下室中培养液,加入结晶紫染色液100 μL/孔,连续完成10 min染色,染色完毕后采用PBS进行2次洗涤,400倍显微镜下連续统计5个视野的细胞并取平均值[15]。

1.3观察指标

①典型基因表达:记录乏氧加抑制剂处理组、乏氧组、抑制剂处理组、对照组各典型基因的表达水平。②增殖率:记录各组干预后12、24、36及48 h的细胞增殖率。③细胞侵袭率:记录各组细胞干预后12 h的细胞侵袭率。

1.4 统计学分析

数据应用SPSS22.0统计学软件进行分析,计量资料用(x±s)表示,采用t检验;计数资料用[n(%)]表示,采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组典型基因标志表达比较

Westernblot检测结果显示,乏氧加抑制剂处理组SMO、GLI1及EMT相关蛋白E-cadherin表达水平分别为(0.32±0.05)、(0.41±0.08)、(0.35±0.06),低于乏氧组的(0.78±0.12)、(0.80±0.14)、(0.79±0.13),低于抑制剂处理组的(0.57±0.11)、(0.62±0.14)、(0.59±0.12),低于对照组的(0.60±0.13)、(0.69±0.16)、(0.67±0.15),差异有统计学意义(P<0.05);乏氧组SMO、GLI1及EMT相关蛋白E-cadherin表达水平高于抑制剂处理组与对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

2.2 各组细胞增殖率比较

BrdU-ELISA法结果显示,乏氧加抑制剂处理组不同时间点细胞增殖率低于乏氧组,高于抑制剂处理组与对照组,差异有统计学意义(P<0.05);乏氧组不同时间点细胞增殖率高于抑制剂处理组与对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3各组细胞侵袭率比较

Transwell法检测结果显示,乏氧加抑制剂处理组细胞侵袭率为(58.56±5.67)%,低于乏氧组的(78.57±6.83)%,但明显高于抑制剂处理组的(27.58±5.31)%与对照组的(37.59±7.21)%,差异有统计学意义(P<0.05);乏氧组细胞侵袭指数高于抑制剂处理组与对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

3 讨论

脑胶质瘤是由大脑和脊髓胶质细胞癌变产生的、最常见的原发性颅脑恶性肿瘤,其发病率占颅内肿瘤的35.2%~61.0%,主要由胶质细胞演化而来,具有发病率高、复发率高及死亡率高等特点,影响患者的健康和生活。缺氧是脑胶质瘤转移的基本特征,持续的缺氧能促进肿瘤侵袭与转移[16]。而介导缺氧应答的主要转录因子在脑胶质瘤中呈高表达,其表达水平与脑胶质瘤的转移、预后存在相关性[17]。目前,临床对于脑胶质瘤的病因尚未明确,可能与肿瘤本身存在紧密联系,其中主要包括病毒感染、化学、电磁辐射及环境等因素。临床研究显示,HIF-1α/HIF-1β转录复合体的稳定与活化激活下游靶基因,调控脑胶质瘤细胞的增殖、血管生成及上皮间质转化(EMT),能促进肿瘤的转移[18]。本研究中Westernblot检测结果显示,乏氧加抑制剂处理组SMO、GLI1及EMT相关蛋白E-cadherin表达水平低于乏氧组、抑制剂处理组与对照组(P<0.05),乏氧组SMO、GLI1及EMT相关蛋白E-cadherin表达水平高于抑制剂处理组与对照组(P<0.05),说明Hedgehog通路在脑胶质瘤转移中呈高表达,且乏氧状态下肿瘤转移率最高,能加剧肿瘤的转移。Hedgehog通路最早在研究果蝇基因突变时被发现,在脊椎动物中其信号通路成员较多,如膜受体Ptch、配体Hh、Smo及下游转录因子Gli。当配体处于功能状态时,Shh、Ptch结合接触,能抑制Smo受体,从而引起下游转录因子激活,能促进细胞的增殖激活。而当配体处于无功能状态时,Ptch对受体能发挥良好的抑制作用,引起Gli发生水解、失效。因此,激活Hh对配体的发育具有重要的作用。本研究中BrdU-ELISA法的结果显示,乏氧加抑制剂处理组不同时间点细胞增殖率低于乏氧组,高于抑制剂处理组与对照组(P<0.05),说明乏氧能促进脑胶质瘤细胞的增殖,而给予细胞抑制剂,则能在一定程度上抑制细胞的增殖。杨宁等[19]的研究结果显示,N-Shh能刺激脑胶质瘤细胞的侵袭、转移,而Hh信号通路特异性阻断剂的干预可降低细胞的侵袭和转移。本研究中Transwell法检测结果显示,乏氧加抑制剂处理组细胞侵袭率低于乏氧组,但明显高于抑制剂处理组与对照组(P<0.05),乏氧组细胞侵袭率高于抑制剂处理组与对照组(P<0.05),说明乏氧加抑制剂处理能降低脑胶质细胞的侵袭和转移,而乏氧则能促进脑胶质细胞的侵袭。姚军利等[20]的研究显示,阻断Hh信号通路能抑制脑胶质瘤细胞的侵袭,可能与Glil抑制血管内皮生长因子的表达有关,从而抑制肿瘤的侵袭和转移。

综上所述,Hedgehog通路可能通过SMO、GLI1调控EMT,参与疾病的發生、发展,在缺氧诱导脑胶质瘤转移中发挥重要的作用,能为脑胶质瘤转移治疗提供新的靶点。

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(收稿日期:2019-12-09)

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